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實驗介紹
【技術原理】
DNA甲基化是基因表達調(diào)控的一種重要機制，DNA甲基化檢測是指利用各種方法對腫瘤細胞DNA甲基化程度進行測定。在惡性腫瘤的發(fā)展中，甲基化的狀態(tài)并不是一成不變，腫瘤細胞內(nèi)全基因組的低甲基化程度與疾病進展、腫瘤大小和惡性程度都有密切的關系，DNA甲基化檢測對腫瘤惡性程度的判斷有重要意義。
甲基化特異性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）
Herman 等（ 1996 ）在使用重亞硫酸鹽處理的基礎上新建的一種方法。該方法敏感性高，主要用于作定性研究。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產(chǎn)物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在甲基化；反之，說明被檢測的位點不存在甲基化。
特點：適用范圍廣，能夠檢測特異位點是否發(fā)生甲基化。
亞硫酸氫鹽測序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）
亞硫酸氫鹽修飾后測序法（ BSP ） Frommer 等（ 1992 ）提出的研究 DNA 甲基化方法，此方法可靠性及精確度高，能明確目的片段中每一個 CpG 位點的甲基化狀態(tài)。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，最后對PCR產(chǎn)物進行測序就可以判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化，稱為BSP-直接測序法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測序法。
特點：精確度高，能夠準確檢測出甲基化的程度百分比。
【實驗流程】
案例展示
常見問題
1、怎樣確定基因的目標區(qū)域來進行甲基化分析呢？
轉(zhuǎn)錄起始位點附近的CpG島進行DNA甲基化分析的首選區(qū)域，一般位于啟動子或者5‘UTR區(qū)。
2、為什么文獻報導的甲基化序列不在CpG島中？
沒有明顯的CpG島不代表就沒有甲基化，甲基化也可能發(fā)生在并不密集的CG區(qū)域。
3、BSP甲基化擴增得到的PCR產(chǎn)物可否直接測序，為什么需要構(gòu)建TA克隆后測序？
如果進行PCR產(chǎn)物測序就有可能在原有的C位點得到雙峰圖，無法確定甲基化的程度。
送檢與交付標準
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動物組織 | 單個樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過量；樣本應盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標記，且標記清晰可識 |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標，樣本盡量新鮮，細胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測）或直接凍存于-80℃ 2. 若細胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標準的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過 10μm，2~8 張，表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應實驗要求的抗體； 2. 按抗體說明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進行實驗，并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應有能夠識別此抗體的標記，抗體的量應大于實驗所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進行預實驗，每個基因至少提供兩對引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
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