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PCR檢測(cè)支原體操作步驟由普拉特澤生物為大家總結(jié)分享，PCR檢測(cè)是支原體檢測(cè)中最常用的實(shí)驗(yàn)方法，其他分別是化學(xué)發(fā)光法、DNA染色法、支原體培養(yǎng)法等。普拉特澤生物表達(dá)檢測(cè)平臺(tái)長(zhǎng)期為廣大基礎(chǔ)科研人員提供支原體檢測(cè)外包服務(wù)，歡迎咨詢。

支原體因?yàn)閭€(gè)頭小，能穿過(guò)0.22 μm濾器，并且在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)會(huì)潛在的擴(kuò)散。支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)液不一定會(huì)發(fā)生混濁。多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。但個(gè)別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落。所以支原體感染會(huì)使培養(yǎng)的細(xì)胞慢慢枯萎，使得用被污染的細(xì)胞樣本做的實(shí)驗(yàn)完全失去
意義和價(jià)值。因此，有必要對(duì)新引進(jìn)的細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的細(xì)胞株進(jìn)行支原體檢測(cè)。

PCR法檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)原理是：原核生物的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)如16S和23S間隔區(qū)，各種生物種間的堿基序列差別很大。這個(gè)間隔區(qū)的DNA 序列及長(zhǎng)度在Mycoplasma 各個(gè)種間既有相對(duì)保守的部分，也有具有很大差異的部分。本制品是在編碼16S 和23S rRNA的DNA 上設(shè)計(jì)一對(duì)F1/R1 引物，擴(kuò)增編碼16 S 和23S rRNA 的DNA 間隔區(qū)。此反應(yīng)體系只特異性擴(kuò)增 Mycoplasma DNA，檢出靈敏度與特異性都很高。

PCR法檢測(cè)支原體操作步驟

如下：

1、支原體樣品預(yù)處理

收集200 ul樣品于PCR管中，12000rpm離心5分鐘，去除上清液，加入30 ul純水或者PBS重懸，然后將其置于95℃加熱10分鐘，冷卻到12℃，最后8000rpm離心2分鐘，上清液為樣品備用。

2、支原引物檢測(cè)

3、PCR檢測(cè)

（1）將合成的引物稀釋成終濃度為100 nmol/L的儲(chǔ)藏液與10 nmol/L的工作液。

（2）配制PCR預(yù)混液。

（3）向以上反應(yīng)混合液中加入檢測(cè)樣品（5ul以下），使總體積達(dá)到50ul。添加樣本時(shí)應(yīng)防止交叉污染。

（4）把反應(yīng)管放入PCR儀中，設(shè)定以下條件，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR的檢測(cè)下限是M. capricolum 1ng， M. hyopneumoniae和U. urealyticum 100pg、其他的Mycoplasma是10pg。但是Human DNA、Mouse DNA在100 ng時(shí)有非特異性片段擴(kuò)增。

（5）預(yù)先配置好1~1.5%的瓊脂糖膠，將完成的PCR反應(yīng)液依次加入到膠孔中并選擇合適的Marker進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

4、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

（1） PCR反應(yīng)的前期操作應(yīng)在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行。

（2）檢測(cè)前，待測(cè)細(xì)胞要用無(wú)雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)7d。

PCR法檢測(cè)支原體因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單、準(zhǔn)確率高成為大家檢測(cè)支原體最常用的方法，那PCR檢測(cè)支原體的步驟和注意事項(xiàng)就給大家介紹到這里啦，如果您還有什么其他的技術(shù)問(wèn)題或支原體檢測(cè)外包的需求歡迎直接留言給客服，技術(shù)會(huì)第一時(shí)間回復(fù)您的哦~

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