RNA pull-down
RNA分子能夠與其他生物分子，如蛋白質(zhì)、DNA和RNA，發(fā)生廣泛的相互作用，從而以大分子復(fù)合物的形式存在于細(xì)胞及生物體中，其中，RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物是RNA存在以及發(fā)揮功能的重要形式之一。RNA pull-down是檢測與RNA（如 miRNA、lncRNA）相互作用的未知蛋白的重要技術(shù)之一。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【技術(shù)原理】
首先標(biāo)記 RNA（如生物素探針標(biāo)記 RNA），將其與細(xì)胞裂解液共同孵育，形成 RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，分離復(fù)合物得到蛋白質(zhì)，通過蛋白免疫印跡（western blot）或質(zhì)譜（massspectrometry）檢測蛋白。
【實(shí)驗(yàn)方法】
Step1：生物素探針標(biāo)記RNA的制備
Step2：RNA抽提
Step3：細(xì)胞裂解
Step4：磁珠預(yù)處理
Step5：RNA與磁珠結(jié)合
Step6：RNA 與蛋白相互作用
Step7：蛋白的檢測
【實(shí)驗(yàn)流程】
案例展示
Samples were normalized by volume. L = lysate load; FT = flow-through, E = eluate.
【結(jié)果分析】
根據(jù)Western blotting檢測結(jié)果可知帶標(biāo)記的AR 3′-UTR RNA可以特異性的結(jié)合HuR蛋白。
技術(shù)總結(jié)
【常見問題】
1、RNA結(jié)合蛋白沒有結(jié)合
可能原因：（1）靶蛋白量不足；（2）緩沖體系不對；（3）RNA探針和蛋白的親和力本來就低。
解決方法：（1）增加上樣蛋白量；（2）應(yīng)用低鹽體系；（3）加入交聯(lián)試劑。
2、RNA 降解
可能原因：無核酸酶的環(huán)境被破壞，比如RNA提取過程中的試劑及材料等；體外轉(zhuǎn)錄的RNA探針降解等。
解決方法：清洗和使用新開的離心管和試劑等；RNA探針合成后，電泳檢測其長度和濃度。
3、RNA結(jié)合蛋白的親和力不夠
可能原因：結(jié)合緩沖環(huán)境沒有優(yōu)化、裂解不完全、磁珠用量不足、RNA探針用量不足等。
解決方法：優(yōu)化孵育時間、溫度、鹽濃度等條件、增加裂解液和蛋白上樣量的比例、適當(dāng)改變磁珠及探針用量、增加裂解液、確定生物素和鏈霉親和素效率等。
4、結(jié)合的非特異性高
可能原因：（1）緩沖環(huán)境沒有優(yōu)化；（2）緩沖環(huán)境嚴(yán)謹(jǐn)性低；（3）樣品沒有裂解完全和裂解體系沒有優(yōu)化。
解決方法：（1）優(yōu)化孵育時間溫度鹽濃度等條件；（2）使用嚴(yán)謹(jǐn)性高的緩沖體系；（3）調(diào)低RNA探針和樣品的比例；（4）提高裂解液的量。
5. WB信噪比高
可能原因：（1）陽性信號率低；（2）一抗效率低；（3）蛋白沒有充分溶解。
解決方法：（1）增加二抗的量；（2）用敏感度的化學(xué)發(fā)光液；（3）用細(xì)胞裂解液預(yù)孵一抗；（4）增加樣品的量；（5）確定有沒有其他可能的結(jié)合情況；（6）增加裂解液用量。
【注意事項(xiàng)】
1、RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體中均需保證無RNase；
2、磁珠與帶標(biāo)簽的RNA要充分混合，可優(yōu)化孵育的溫度、時間以及RNA的含量等。
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動物組織 | 單個樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過量；樣本應(yīng)盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識 |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標(biāo)、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標(biāo)，樣本盡量新鮮，細(xì)胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測）或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過 10μm，2~8 張，表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體； 2. 按抗體說明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識別此抗體的標(biāo)記，抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個基因至少提供兩對引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
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