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實驗介紹
【應用簡介】
BSP又稱亞硫酸氫鹽測序法（Bisulfite sequencing PCR），結合重亞硫酸鹽的測序法是一種靈敏的能直接檢測分析基因組DNA甲基化模式的方法。
【技術原理】
使用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)都被轉化為尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶則不變。設計針對甲基化序列的引物并進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增，經瓊脂糖凝膠電泳，將符合預期的產物純化回收連接T載體，進行陽性克隆測序，即可了解每個CpG位點的甲基化情況。通過統計分析，即可判斷某個特定基因特定CpG島區(qū)段內的甲基化程度。
【實驗流程】
1、引物設計與測試；
2、基因組提?。?/span>
3、亞硫酸氫鈉修飾DNA并純化回收修飾產物；
4、PCR擴增、產物回收并連入T載；
5、測序分析；
6、甲基化分析與數據統計。
案例展示
BSP克隆子的原始測序結果
圖1 測序結果比對示例
圖2 測序結果統計點狀圖
注：每個圓圈代表一個CG位點，黑圈代表甲基化，白圈代表未甲基化；每一行代表一個樣本 TA 克隆的一個測序結果。
圖3 各樣本基因檢測區(qū)段組間的甲基化水平差異分析
常見問題
1、怎樣確定基因的目標區(qū)域來進行甲基化分析呢？
轉錄起始位點附近的CpG島進行DNA甲基化分析的首選區(qū)域，一般位于啟動子或者5‘UTR區(qū)。
2、 為什么文獻報導的甲基化序列不在CpG島中？
CpG島是甲基化密集區(qū)域，但是沒有明顯的CpG島不代表就沒有甲基化，甲基化也可能發(fā)生在并不密集的CG區(qū)域。
3、BSP甲基化擴增得到的PCR產物可否直接測序，為什么需要構建TA克隆后測序？
PCR產物是不同樣本的混合體，直接用PCR產物測序有可能在原有的C位點得到雙峰圖，以及由于測序前面一段序列不可靠而影響部分甲基化位點的判讀，無法準確地確定甲基化的程度，因此建議進行TA克隆后測序。
送檢與交付標準
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動物組織 | 單個樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過量；樣本應盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標記，且標記清晰可識 |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標，樣本盡量新鮮，細胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測）或直接凍存于-80℃ 2. 若細胞處理（加藥、轉染、感染）后狀態(tài)差應酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標準的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過 10μm，2~8 張，表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應實驗要求的抗體； 2. 按抗體說明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進行實驗，并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應有能夠識別此抗體的標記，抗體的量應大于實驗所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進行預實驗，每個基因至少提供兩對引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
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