WB檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告和詳細(xì)的操作步驟（下）
2023-12-21 14:42:54
來(lái)源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺(tái)
前兩篇我們總結(jié)了WB檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告以及詳細(xì)的操作步驟，今天來(lái)學(xué)習(xí)WB實(shí)驗(yàn)報(bào)告的最后一篇吧，希望大家加強(qiáng)學(xué)習(xí)~
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中篇：WB檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告和詳細(xì)的操作步驟（中）
鏈接奉上，大家快點(diǎn)踩著春風(fēng)學(xué)院的肩膀去摘蘋(píng)果吧！那現(xiàn)在我們來(lái)接著講解：
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2、NF-κB蛋白在樣本中的表達(dá)。
二、實(shí)驗(yàn)樣本及分組
2.1 實(shí)驗(yàn)樣本
2.2 實(shí)驗(yàn)分組
細(xì)胞：Huh7，Hep3B，Huh7-CR細(xì)胞
分組：Control、CAFs、Sorafenib、Sorafenib+CAFs
指標(biāo)：Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2、NF-κB
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 抗體工作信息
3.2正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果
WB檢測(cè)各組細(xì)胞樣本中Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2、NF-κB蛋白的表達(dá)水平
圖1： WB表達(dá)水平檢測(cè)圖
圖2：WB檢測(cè)灰度數(shù)據(jù)柱形圖
四、實(shí)驗(yàn)材料
5.1主要儀器
5.2 主要試劑
五、實(shí)驗(yàn)原理
蛋白免疫印跡( Western Blot) 采用的是聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的特異性抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。
六、實(shí)驗(yàn)步驟
7.1.蛋白提取
(1)樣本的收集：
細(xì)胞：用1 ml生理鹽水對(duì)離心下來(lái)的細(xì)胞進(jìn)行洗滌，同時(shí)將其轉(zhuǎn)移至1.5 ml的離心管中。
組織：取適量組織剪碎，研磨勻漿。
(2)按1 ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）
(3)根據(jù)細(xì)胞量的多少，每管細(xì)胞加100-500 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min。
(4)4℃下12000 rpm離心10 min。離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移至1.5 ml的離心管中，用于蛋白定量檢測(cè)。若不能及時(shí)定量蛋白濃度，請(qǐng)置于－80℃保存。
7.2.蛋白定量及處理（BCA法）
(1)使用時(shí)將BCA試劑盒中 Solution A搖晃混勻，根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積Solution A加1體積Solution B(50:1)配置適量BCA工作液，充分混勻后即成淡綠色的工作液。BCA工作液室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定。
(2)將標(biāo)準(zhǔn)品（1mg/ml BSA）按0、1、2、4、6、8、10 μl的量分別加入96孔板中，再加入去離子水將所有標(biāo)準(zhǔn)品補(bǔ)足到10 μl。
(3)加1 μl的樣品到96孔板中，加去離子水補(bǔ)足到10 μl。
(4)各孔加入200 μl BCA工作液，輕輕用移液器吹打混勻（注意不要產(chǎn)生氣泡以免影響讀數(shù)），37℃孵育30 min。
(5)冷卻到室溫后，用酶標(biāo)儀測(cè)定A562的吸光度值。
(6)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。
(7)蛋白變性處理：蛋白溶液與5×loading buffer 按照體積比4：1混勻（此時(shí)蛋白濃度變成實(shí)際檢測(cè)濃度的0.8倍），置于沸水中煮10min，冷卻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，或儲(chǔ)存于-80℃，避免反復(fù)凍融。
(8)蛋白濃度的計(jì)算公式
舉例標(biāo)曲為：Y=aX+b(Y為OD值，X為測(cè)定濃度）
樣品蛋白濃度=[（Y-b）/a]×稀釋倍數(shù)
7.3.Western Blot
(1)配制分離膠和濃縮膠：根據(jù)目的蛋白分子量大小，配分離膠和5%濃縮膠；
蛋白分子量（kDa）分離膠濃度%
(2)上樣：計(jì)算含20 μg蛋白的溶液體積，即為上樣量。用1×loading buffer 補(bǔ)至每個(gè)加樣孔的總體積一致；
(3)電泳：濃縮膠電壓為80 V，40 min，分離膠電壓120 V，30-50 min。溴酚藍(lán)跑至膠底即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；
(4)轉(zhuǎn)膜：恒壓100V，0.45μm PVDF膜；
(5)封閉：將PVDF膜完全浸沒(méi)在5% milk-PBST或5% BSA-PBST中，室溫輕搖60 min或4℃過(guò)夜；
(6)一抗孵育：用5% BSA-PBST稀釋一抗，4℃孵育過(guò)夜；
(7)洗膜：次日取出PVDF膜，PBST洗膜5次，每次6 min；
(8)二抗孵育：PBST稀釋二抗，室溫孵育60 min；
(9)洗膜：PBST洗膜5次，每次6 min；
(10)顯影：ECL A和B液按體積1:1混合后均勻滴加在膜上，按需求設(shè)置曝光時(shí)間及曝光類(lèi)型，開(kāi)始曝光，曝光結(jié)束后保存圖片并導(dǎo)出圖片。
7.4.圖像分析
用圖像分析軟件Image J對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。
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