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在RACE實(shí)驗(yàn)中，提高擴(kuò)增特異性和效率是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。以下是一些新方法，可以幫助你在進(jìn)行RACE實(shí)驗(yàn)時(shí)提高擴(kuò)增的特異性和效率：

一、優(yōu)化引物設(shè)計(jì)

?▲選擇合適的引物長(zhǎng)度和GC含量?：

引物長(zhǎng)度建議為23~28個(gè)核苷酸，GC含量為50%~70%。

較高的GC比例和Tm值（≥65℃，若>70℃使用Touchdown PCR）有助于提高產(chǎn)物的特異性。

?▲設(shè)計(jì)多條基因特異性引物（GSP）?：

針對(duì)同一待測(cè)轉(zhuǎn)錄本可設(shè)計(jì)多條GSP，以提高擴(kuò)增成功率。

若擴(kuò)增效果仍然欠佳，則讓NGSP（巢式引物）的5'末端與GSP的3'末端有5~15個(gè)核苷酸的重疊，有助于提高二輪巢式擴(kuò)增時(shí)的特異性。

▲避免引物自互補(bǔ)和錯(cuò)配?：

避免使用自身互補(bǔ)性的引物序列，否則會(huì)產(chǎn)生回折和形成分子內(nèi)氫鍵。

如果引物的3'末端有大約10個(gè)堿基和某個(gè)已知基因100%匹配，應(yīng)堅(jiān)決棄之不用，以避免后續(xù)的PCR反應(yīng)中將此基因擴(kuò)增出來(lái)。

二、改進(jìn)反轉(zhuǎn)錄和PCR條件

?●選擇合適的反轉(zhuǎn)錄酶?：

3'端的cDNA可使用MMLV酶，而5'端的cDNA則需要更高要求的SMARTScribe酶。

使用具有模板置換活性的逆轉(zhuǎn)錄酶和高保真快速擴(kuò)增，可提高反轉(zhuǎn)錄和PCR的效率。

?●優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件?：

采用熱啟動(dòng)PCR和Touchdown PCR技術(shù)，可提高PCR反應(yīng)的特異性。

Touchdown PCR是在最開(kāi)始的循環(huán)中，退火溫度高于引物的Tm值，以增加對(duì)特異性條帶的擴(kuò)增；隨后的退火和延伸的溫度降回到引物的Tm值，進(jìn)行隨后的PCR循環(huán)。

若擴(kuò)增目的片段>3kb，72℃延伸時(shí)長(zhǎng)延長(zhǎng)至1min；對(duì)于較長(zhǎng)（>10kb）或豐度較低的轉(zhuǎn)錄本，GSP盡量靠近c(diǎn)DNA末端。

●減少非特異性擴(kuò)增?：

使用低濃度的外側(cè)引物，并減少第一輪PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)。

然后取第一輪反應(yīng)產(chǎn)物的1/10~1/20用于一對(duì)內(nèi)側(cè)引物的巢式PCR，進(jìn)行35~40個(gè)循環(huán)。

三、提高RNA質(zhì)量和完整性

?▲使用高質(zhì)量的RNA提取方法?：

盡量保證RNA的純度，如使用柱式RNA提取試劑盒。

在反轉(zhuǎn)錄前檢測(cè)RNA的完整度，可通過(guò)紫外分光光度原理的方法（如NanoDrop）檢查A260/A280值（代表蛋白殘留的程度，一般在2.0左右）和A260/A230的值（表示鹽離子、酚、醇等的殘留程度，一般在2.0~2.2）；
或通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性（條帶是否清晰，是否有完整的2~3條RNA條帶）。

?▲避免RNA降解和污染?：

【1】RNA提取物中無(wú)目的轉(zhuǎn)錄本或者目的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)豐度低時(shí)，可以設(shè)計(jì)已知轉(zhuǎn)錄本區(qū)域的qPCR或PCR引物進(jìn)行目的產(chǎn)物檢測(cè)；檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)表達(dá)豐度低，可以增加RNA模板投入量。

【2】RNA質(zhì)量直接影響到反轉(zhuǎn)錄的效率和cDNA的質(zhì)量。如果RNA有降解或者含有DNA或蛋白質(zhì)污染，可能導(dǎo)致反轉(zhuǎn)錄效率降低，或者合成的cDNA質(zhì)量差，這些都會(huì)影響到后續(xù)的PCR擴(kuò)增。

▲其他注意事項(xiàng)

?【1】RNA質(zhì)量?：RNA的質(zhì)量直接影響到反轉(zhuǎn)錄的效率和cDNA的質(zhì)量。因此，在進(jìn)行RACE之前，需要使用高質(zhì)量的RNA提取方法，盡量保證RNA的純度。同時(shí)，操作前必須檢測(cè)RNA的完整度。

【2】試劑盒選擇?：選擇高質(zhì)量的RACE擴(kuò)增試劑盒，如全式金推出的TransScript? 5'/3' RACE Kit，該試劑盒包含熱穩(wěn)定性高、合成速度快且具有模板置換活性的逆轉(zhuǎn)錄酶和高保真快速擴(kuò)增，可以提高擴(kuò)增的特異性和效率。

綜上所述，通過(guò)優(yōu)化引物設(shè)計(jì)、選擇合適的反轉(zhuǎn)錄酶與PCR條件、應(yīng)用巢式PCR技術(shù)以及注意RNA質(zhì)量和試劑盒選擇等方面的方法，可以提高RACE實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增特異性和效率。

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