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    大家好！今天普拉特澤生物繼續(xù)跟大家一起學習新的技術——RNAi研究策略與siRNA的設計。
RNAi（RNA干擾）是一種強大的生物學工具，用于研究基因功能、疾病治療等領域。在shRNA,siRNA等小RNA的介導下，RNAi能夠特異性的調(diào)控mRNA在表觀遺傳學水平，轉錄水平以及轉錄后水平的表達。
一、siRNA和shRNA的簡介
小干擾RNA（Small interfering RNA，簡稱siRNA）是一類雙鏈RNA分子，長度通常在20到25個核苷酸之間。siRNA由兩條互補的RNA鏈組成，每條鏈的3'端通常具有兩個未配對的核苷酸（通常是UU）。

siRNA

短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，簡稱shRNA）是一種具有環(huán)狀結構的RNA分子。shRNA由兩個短反向重復序列和一個中間的莖環(huán)（loop）序列組成，整體呈發(fā)夾狀結構。shRNA通常由pol Ⅲ啟動子控制轉錄。

shRNA

shRNA表達載體

RNAi是一種由雙鏈RNA（dsRNA）介導的、序列特異性的基因沉默機制。當細胞中存在與靶基因mRNA序列互補的dsRNA時，這種dsRNA會被細胞內(nèi)的Dicer酶切割成多個具有特定長度和結構的小片段RNA，即小干擾RNA（siRNA）。這些siRNA隨后與RNA誘導的沉默復合物（RISC）結合，形成活化的RISC復合物。RISC復合物具有核酸酶的功能，能夠識別并切割與siRNA互補的靶mRNA序列，導致靶mRNA的降解，從而抑制靶基因的表達。dsRNA可以通過多種方式引入細胞，如人工合成、病毒侵染、轉基因表達等。
一、RNAi研究策略
1. 直接合成siRNA

方法：通過化學方法合成針對靶基因的siRNA，然后通過轉染試劑將其導入細胞內(nèi)，引發(fā)RNAi效應。

2. 構建shRNA表達載體

方法：將短發(fā)夾RNA（shRNA）序列克隆到質(zhì)粒或病毒載體中，轉染細胞后，在細胞內(nèi)轉錄生成shRNA，再被Dicer酶切割成siRNA，發(fā)揮RNAi作用。

3.構建shRNA病毒表達載體

方法：利用腺病毒、腺相關病毒、慢病毒等病毒載體，將shRNA序列包裝成病毒顆粒，感染細胞后表達shRNA。

二、shRNA設計步驟
設計原則：

當選擇U6啟動子時，建議靶向序列以G堿基開頭，以確保RNA聚合酶的有效轉錄。

避免選擇GC含量過高或過低的區(qū)域，因為這可能影響shRNA的穩(wěn)定性和干擾效率

在正義鏈和反義鏈序列上不能出現(xiàn)連續(xù)的3個或者3個以上的T，這可能導致RNA polⅢ的轉錄提前終止

需要在shRNA序列的尾部加入5-6個T作為RNA聚合酶III的轉錄終止子，以確保轉錄的精確結束。

shRNA引物設計步驟：（載體為pPLKO.1為例）

今天關于RNAi研究策略與siRNA的設計就分享到這兒啦~如果您在實驗過程中遇到技術問題，或者需要實驗外包和代做，可與我們技術老師聯(lián)系18570028002（微信同號）