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普拉特澤生物承接細(xì)胞周期檢測(cè)、原代及干細(xì)胞鑒定、細(xì)胞凋亡檢測(cè)等流式相關(guān)服務(wù)上萬(wàn)例，積累了操作大量經(jīng)驗(yàn)

為大家詳細(xì)分享巨噬細(xì)胞極化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)為廣大科研工作者開展線上的理論培訓(xùn)與線下實(shí)操，可承接流式等實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)

做免疫實(shí)驗(yàn)的小伙伴，誰(shuí)還沒“養(yǎng)”過(guò)巨噬細(xì)胞？

作為我們固有免疫和適應(yīng)性免疫中的關(guān)鍵角色，巨噬細(xì)胞簡(jiǎn)直是免疫界的“變形金剛”。它們的可塑性極強(qiáng)，能根據(jù)周圍環(huán)境信號(hào)，極化成不同的功能亞型。

最經(jīng)典的分型，莫過(guò)于M1（經(jīng)典活化）和M2（替代活化）了。

• M1型： 促炎“戰(zhàn)斗機(jī)”，負(fù)責(zé)抗腫瘤、殺病菌。
• M2型： 抗炎“維修工”，負(fù)責(zé)組織修復(fù)、傷口愈合。

為了研究它們，大家通常會(huì)從健康人外周血中分離純化出單核細(xì)胞，用M-CSF誘導(dǎo)7天，獲得人單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞（MDMs）。

然后，用不同的“雞尾酒”去刺激它們，使其極化成不同的亞型：

聽起來(lái)很簡(jiǎn)單？但魔鬼藏在細(xì)節(jié)中。

一個(gè)靈魂拷問：你一般在刺激后第幾小時(shí)去收樣檢測(cè)？

是6小時(shí)？24小時(shí)？還是48小時(shí)？

我們經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，文獻(xiàn)A說(shuō)24小時(shí)能看到某標(biāo)志物高表達(dá)，文獻(xiàn)B說(shuō)48小時(shí)才行，而你自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻是陰性……

為什么？

因?yàn)槟壳盀橹?，?duì)于這些標(biāo)志物檢測(cè)的“最佳時(shí)間點(diǎn)”，業(yè)內(nèi)根本沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)！

巨噬細(xì)胞的極化是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的過(guò)程，不同標(biāo)志物的表達(dá)模式（mRNA和蛋白）隨時(shí)間變化極大。如果你在“次優(yōu)”時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)，很可能得到“假陰性”結(jié)果，這不僅浪費(fèi)時(shí)間，更可能讓你與真相失之交臂。

為了解決這個(gè)大難題，土耳其Duygu Unuvar Purcu等人做了一件“功德無(wú)量”的事：他們把M1、M2a、M2c的所有常用標(biāo)志物，在4h, 8h, 12h, 24h, 48h, 72h 這一系列時(shí)間點(diǎn)上，從mRNA到蛋白水平（流式、ELISA）全都測(cè)了一遍！

今天，我們就來(lái)“抄一下作業(yè)”。

M1型 (促炎“戰(zhàn)斗機(jī)”)：手快有，手慢無(wú)！

用  刺激后，M1的反應(yīng)非常迅速，但也非?！熬帧?。

1、mRNA 水平 (qPCR)

• “急性子” (4小時(shí)達(dá)峰)： CXCL9, CXCL10, TNF 這三個(gè)M1關(guān)鍵基因的mRNA水平，在4小時(shí)就飆到了頂峰！隨后開始逐漸下降。
• 劃重點(diǎn)： 如果你習(xí)慣性地等到24小時(shí)或48小時(shí)才去收RNA，你看到的只是“峰后殘影”，甚至可能錯(cuò)過(guò)整個(gè)表達(dá)高峰。
• “穩(wěn)定型” (4小時(shí)后穩(wěn)定)： IL-1β 在4小時(shí)顯著上調(diào)后，能在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)（直至72小時(shí)）都保持穩(wěn)定高表達(dá)。
• “晚熟型” (48小時(shí)后起飛)： IDO1 是個(gè)例外，它的表達(dá)隨時(shí)間持續(xù)增加，在48-72小時(shí)才達(dá)到最高值。
• “最奇怪的” (先降后升)： IL-12 的基因表達(dá)在4小時(shí)反而下降了，直到48小時(shí)才開始顯著飆升。

2、蛋白水平 (流式細(xì)胞術(shù) & ELISA)

• 流式（表面標(biāo)志物）：
• CD86 和 HLA-DR 是“短時(shí)高峰”，在12小時(shí)達(dá)到最強(qiáng)，24小時(shí)后反而會(huì)回落（可能是因?yàn)榧?xì)胞因子IL-10的負(fù)反饋調(diào)節(jié)）。
• CD64 是最可靠的“晚期”M1表面標(biāo)志物，從8小時(shí)開始上調(diào)，24-72小時(shí)持續(xù)走高。
• ELISA（分泌蛋白）：
• TNF（腫瘤壞死因子）在4-12小時(shí)分泌量最高。
• IL-1β 在8-24小時(shí)這個(gè)時(shí)間窗口檢測(cè)最佳。
• IL-12p70 在4小時(shí)很低，但在8-72小時(shí)都能穩(wěn)定檢測(cè)到高水平。

M1小結(jié)：M1的反應(yīng)風(fēng)風(fēng)火火。想看基因？4-8小時(shí)是黃金時(shí)間。想看流式表面蛋白？12小時(shí)看CD86/HLA-DR，24小時(shí)后看CD64。想看分泌的細(xì)胞因子？8-24小時(shí)是檢測(cè)M1“三巨頭”（TNF, IL-1β, IL-12）的最佳窗口。

M2a型 (修復(fù)“醫(yī)療兵”)：耐心，是最大的美德

用  刺激誘導(dǎo)的M2a型，整體反應(yīng)偏“慢”，需要你耐心等待。

1、mRNA 水平 (qPCR)

• “穩(wěn)步增長(zhǎng)型”： MRC1 (CD206) 和 TGM2 在4小時(shí)就被誘導(dǎo)，穩(wěn)步增長(zhǎng)，直到72小時(shí)才達(dá)到最高峰。
• “持續(xù)高能型”： CCL17 在所有時(shí)間點(diǎn)都保持非常高的表達(dá)量。
• “逐漸上量型”： CCL22 從4小時(shí)到48小時(shí)逐漸增加。
• “驚天逆轉(zhuǎn)”： 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在  刺激下，IL-10的mRNA水平居然是逐漸下降的！
• 劃重點(diǎn)： 這和很多使用THP-1細(xì)胞系（24小時(shí)IL-10上調(diào)）的報(bào)道完全相反！這再次證明了原代細(xì)胞和細(xì)胞系之間存在巨大差異，做原代細(xì)胞不能照搬細(xì)胞系的經(jīng)驗(yàn)！

2、蛋白水平 (流式細(xì)胞術(shù) & ELISA)

• 流式（表面標(biāo)志物）：
• CD200R 和 CD206 (MRC1) 這兩個(gè)M2a的“金標(biāo)準(zhǔn)”標(biāo)志物，都是晚期標(biāo)志物。它們從8小時(shí)開始緩慢上調(diào)，在48-72小時(shí)達(dá)到最高水平。
• 劃重點(diǎn)： 如果你只刺激了24小時(shí)就去看CD206，很可能因?yàn)楸磉_(dá)量不夠高而“假陰性”。
• ELISA（分泌蛋白）：
• 雖然mRNA在M2a中沒有上調(diào)，但 IL-10 蛋白 確實(shí)分泌了！不過(guò)非常晚，在48-72小時(shí)才能檢測(cè)到顯著水平。

M2a小結(jié)：研究M2a表型，“耐心” 是關(guān)鍵詞。無(wú)論是看流式（CD206/CD200R）還是ELISA（IL-10），都請(qǐng)至少等到48小時(shí)，最好是72小時(shí)。

M2c型 (抗炎“清道夫”)：mRNA和蛋白的“時(shí)差”

用  刺激誘導(dǎo)的M2c型，展現(xiàn)了mRNA和蛋白表達(dá)之間巨大的“時(shí)間差”。

1、mRNA 水平 (qPCR)

• “早高峰”： IL-10 的mRNA水平在4小時(shí)就達(dá)到了頂峰。
• “穩(wěn)定型”： CD163 的mRNA在4小時(shí)到72小時(shí)都維持穩(wěn)定表達(dá)。
• “人間蒸發(fā)”： 在所有檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，均未檢測(cè)到TGFβ的基因表達(dá)！

2、蛋白水平 (流式細(xì)胞術(shù) & ELISA)

• 流式（表面標(biāo)志物）：
• CD163 蛋白的表達(dá)在24-72小時(shí)開始增加（盡管存在較大的供體差異）。這與4小時(shí)mRNA就穩(wěn)定的情況形成了“時(shí)差”。
• ELISA（分泌蛋白）：
• 最大的“時(shí)差”來(lái)了： 盡管沒有檢測(cè)到TGFβ的mRNA，但在72小時(shí)，檢測(cè)到了非常顯著的TGFβ蛋白分泌！
• 劃重點(diǎn)： 這說(shuō)明細(xì)胞可能早已轉(zhuǎn)錄好mRNA，或者現(xiàn)有的mRNA已足夠維持蛋白合成，也可能蛋白是合成后積累在胞內(nèi)，到晚期才集中釋放。千萬(wàn)不要因?yàn)閝PCR測(cè)不到mRNA，就斷言沒有蛋白功能！

M2c小結(jié)：M2c充分展示了科研的復(fù)雜性?？磎RNA（IL-10）要趁早（4h），看蛋白（CD163/TGFβ）要趁晚（24-72h）。

終極“抄作業(yè)”指南：黃金時(shí)間表（建議收藏）

說(shuō)了這么多，一張圖（表）總結(jié)所有知識(shí)點(diǎn)。下次做實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)直接對(duì)照這張表來(lái)安排時(shí)間！

表1：人單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞中M1, M2a, M2c極化標(biāo)志物的建議檢測(cè)時(shí)間注：nd (no significant upregulation was detected)，未檢測(cè)到明顯上調(diào)。

總結(jié)：

1. 沒有“一刀切”的時(shí)間點(diǎn)： M1標(biāo)志物（特別是mRNA）反應(yīng)快，M2標(biāo)志物（特別是蛋白）反應(yīng)慢。
2. 原代細(xì)胞 ≠ 細(xì)胞系： M2a中IL-10 mRNA的下降，警示我們不能盲目套用THP-1等細(xì)胞系的數(shù)據(jù)。
3. mRNA ≠ 蛋白： M2c中TGFβ的表達(dá)差異，提醒我們mRNA和蛋白的檢測(cè)結(jié)果必須結(jié)合分析，不能相互推斷。

有了這份指南，你就可以根據(jù)自己想檢測(cè)的特定標(biāo)志物，精確安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間，告別“假陰性”，提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和可比性！

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