在細(xì)胞培養(yǎng)中遇到“小黑點(diǎn)”如何處理？【技術(shù)分享】
2021-06-11 11:09:45
來(lái)源/作者：普拉特澤生物-醫(yī)學(xué)整體課題外包
細(xì)胞在培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有黑點(diǎn)生成，可以通過(guò)：
1、肉眼觀察培養(yǎng)基是否混濁；
2、同時(shí)在鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)，黑點(diǎn)是否游動(dòng)，來(lái)進(jìn)行判斷污染的類型。
如果細(xì)胞被微生物污染，則細(xì)胞形態(tài)會(huì)以肉眼可見的速度發(fā)生改變。要判定是否為細(xì)菌污染，可以通過(guò)以下幾點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)：
1）觀察培養(yǎng)基是否變渾濁，變黃；
2）細(xì)胞狀態(tài)明顯變差；
3）鏡下觀察黑點(diǎn)是否游動(dòng)或翻滾，要注意與布朗運(yùn)動(dòng)區(qū)別。
針對(duì)污染問(wèn)題最重要的是防患于未然，向培養(yǎng)基添加雙抗是最常用的避免細(xì)菌污染的方法，同時(shí)進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌操作。
若是培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)被細(xì)菌污染，建議使用消毒劑處理后直接丟棄；若細(xì)胞較珍貴，則采用5-10倍的抗生素沖洗，作用24-48h，再換成常規(guī)培養(yǎng)基。
如果在鏡下觀察細(xì)胞，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，與黑點(diǎn)出現(xiàn)前相比，細(xì)胞狀態(tài)沒(méi)有發(fā)生明顯變化。黑點(diǎn)的出現(xiàn)可能與以下幾種情況有關(guān)：
1）細(xì)胞因老化出現(xiàn)的破碎的細(xì)胞殘骸；
2）血清經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融產(chǎn)生的沉淀；
3）配制培養(yǎng)基的pH值偏高，不宜細(xì)胞生長(zhǎng)；
4）培養(yǎng)原代細(xì)胞中出現(xiàn)小黑點(diǎn)，可能是原代組織中的雜質(zhì)，多次傳代可以消除。
針對(duì)于這種情況，可以采用以下幾種方法進(jìn)行去除：
1）離心300-500rpm 3min左右分離完整細(xì)胞和碎片；
2）掌握細(xì)胞傳代的最佳時(shí)機(jī)，盡可能地減少血清凍融次數(shù)；
3）將培養(yǎng)基配制成適宜細(xì)胞生長(zhǎng)的pH值；
4）如果是貼壁細(xì)胞，用D-Hanks或PBS洗，再更換新鮮培養(yǎng)基。
還有一種可能，小黑點(diǎn)是血清熱滅活的沉淀物。血清經(jīng)過(guò)熱處理后，沉淀物的形成會(huì)顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)”，常會(huì)被誤認(rèn)為遭受污染，將血清放置37℃溫育，往往使情況變得更糟，血清中的蛋白進(jìn)一步的析出，所以誤認(rèn)為是微生物增殖，但檢測(cè)培養(yǎng)基，是沒(méi)有被污染的。多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)中血清的熱滅活并不是必要的，很多情況下，熱滅活并不會(huì)改善細(xì)胞的生長(zhǎng)，卻降低了支持細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。若非實(shí)驗(yàn)必須，不建議對(duì)血清采取熱滅活操作。
所以，一般情況下，若非微生物污染所致，小黑點(diǎn)是不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)的，可以按照上述步驟排除成因并采取相應(yīng)處理措施，如果細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，可嘗試更換新的批號(hào)。另外進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作之前，將培養(yǎng)基平衡到室溫即可，無(wú)需用37℃水浴加熱。
以上就是關(guān)于
細(xì)胞培養(yǎng)中常見的“小黑點(diǎn)”問(wèn)題處理方法
是不是已經(jīng)幫您弄清楚了呢？
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