做骨穩(wěn)態(tài)研究，總離不開(kāi)這幾個(gè)關(guān)鍵詞：成骨、成脂、成軟骨、增殖、分化、凋亡。成骨及破骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡最終決定骨形成及骨吸收，共同構(gòu)建骨穩(wěn)態(tài)平衡。

今天帶大家讀一篇機(jī)制不復(fù)雜，但思路很清晰，邏輯較嚴(yán)密的骨穩(wěn)態(tài)文章。

其實(shí)小編一直是很喜歡看骨科相關(guān)的研究文章的，沒(méi)別的原因，就是染色好看！

分享一些小編的骨組織染色案例

文獻(xiàn)：

Title：Cytl1通過(guò)調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨和破骨細(xì)胞生成來(lái)調(diào)節(jié)小鼠的骨穩(wěn)態(tài)

關(guān)鍵詞：Cytl1、間充質(zhì)干細(xì)胞、骨穩(wěn)態(tài)

以前的研究表明，敲除Cytl1（Cytl1-/-）的小鼠表現(xiàn)出正常的軟骨內(nèi)骨化和長(zhǎng)骨發(fā)育。本文中，作者研究了Cytl1在骨穩(wěn)態(tài)中的潛在功能，發(fā)現(xiàn)Cytl1?/? 小鼠的骨量比野生型同窩小鼠高，并且抵抗卵巢切除誘導(dǎo)的骨吸收。

作者研究了Cytl1在骨髓干細(xì)胞的成骨和破骨細(xì)胞生成中的功能，發(fā)現(xiàn)在人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）的成骨過(guò)程中，Cytl1被下調(diào)。Cytl1能夠通過(guò)抑制RUNX2從而降低成骨作用，促進(jìn)未分化hMSCs的增殖，也刺激成骨分化細(xì)胞的凋亡。Cytl1?/?敲除小鼠表現(xiàn)出對(duì)破骨細(xì)胞活性的抑制和巨噬細(xì)胞的破骨細(xì)胞生成。這些結(jié)果共同表明：

1、Cytl1抑制RUNX2從而抑制成骨分化，促進(jìn)未分化的hMSCs增殖，促進(jìn)已分化的hMSCs凋亡。

2、Cytl1?/?敲除抑制破骨細(xì)胞的生成和活性。

總結(jié)：Cytl1負(fù)調(diào)節(jié)hMSCs的成骨分化，并正調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成及小鼠骨量。

在骨穩(wěn)態(tài)的研究中，尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞的三系分化檢測(cè)中，有幾項(xiàng)常見(jiàn)的染色技術(shù)羅列如下：

另外還有破骨細(xì)胞的TRAP染色，軟骨組織的番紅固綠染色等。

有相關(guān)染色需要的甲方爸爸們可趁著618 和3周年慶期間來(lái)跟我們薅羊毛。

正文開(kāi)始，我們來(lái)過(guò)一下本文的結(jié)果呈現(xiàn)，然后好好學(xué)習(xí)一下別人是怎么把一個(gè)基因的功能坐實(shí)的。

作者首先通過(guò)檢查Cytl1?/? 小鼠和WT同窩小鼠的骨量來(lái)檢查Cytl1是否調(diào)節(jié)長(zhǎng)骨的體內(nèi)平衡。與WT同窩小鼠相比，Cytl1?/? 小鼠的骨量增加，骨小梁體積和骨小梁厚度增加，同時(shí)伴隨小梁分離減少，Cytl1?/? 小鼠的小梁數(shù)和每個(gè)骨周長(zhǎng)的成骨細(xì)胞數(shù)也顯著高于WT同窩小鼠。

這些結(jié)果表明，Cytl1功能的喪失會(huì)誘導(dǎo)小鼠骨量的增加。為進(jìn)一步闡明Cytl1在骨穩(wěn)態(tài)中的體內(nèi)意義，作者檢測(cè)了小鼠Cytl1敲除是否可以減輕卵巢切除（OVX）誘導(dǎo)的骨吸收。正如預(yù)期的那樣，卵巢切除的WT小鼠股骨遠(yuǎn)端的μCT分析顯示骨小梁骨丟失，Cytl1-/-缺失組小鼠骨小梁相對(duì)正常，但兩組之間皮質(zhì)骨沒(méi)有顯著差異。

接著，為了闡明Cytl1對(duì)骨量調(diào)節(jié)的可能機(jī)制，作者將hMSCs分別誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞（也就是我們前文所說(shuō)的三系分化），QPCR檢測(cè)Cytl1的mRNA水平。結(jié)果顯示：在hMSCs的成軟骨過(guò)程中，Cytl1的表達(dá)瞬時(shí)增加，但在成脂期間減少，并一直保持在低水平直至分化的晚期。相反，Cytl1表達(dá)在早期顯著降低成骨的階段，并且在分化的晚期階段表現(xiàn)出輕微的恢復(fù)。

Cytl1的差異表達(dá)模式表明它可能在hMSCs的三系分化期間發(fā)揮不同的功能。作者通過(guò)用編碼人Cytl1（Ad-Cytl1）的腺病毒感染hMSC細(xì)胞過(guò)表達(dá)Cytl1，再次誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行三系分化。發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Cytl1不影響軟骨形成或脂肪形成。通過(guò)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第18天的茜素紅染色確定，Ad-Cytl1的感染劑量依賴(lài)性地抑制hMSC的成骨。當(dāng)進(jìn)一步檢查Cytl1是否調(diào)節(jié)hMSCs表型轉(zhuǎn)化時(shí)，F(xiàn)ACS（熒光激活細(xì)胞分選）分析結(jié)果顯示Cytl1的過(guò)表達(dá)不影響hMSCs標(biāo)記物：CD29，CD44和CD90的表達(dá)。這表明：Cytl1負(fù)調(diào)節(jié)hMSCs的成骨分化，但不影響成軟骨或成脂分化。且這一調(diào)節(jié)作用并不引起hMSCs的表型變化。

接下來(lái)作者檢查了Cytl1敲低對(duì)hMSC成骨的影響。人Cytl1基因特異shRNA慢病毒感染MSCs。通過(guò)茜素紅染色和培養(yǎng)第18天的礦化定量評(píng)估發(fā)現(xiàn)，Cytl1的敲低顯著促進(jìn)成骨作用，且敲除Cytl1不影響hMSC標(biāo)記物CD29，CD44和CD90表達(dá)水平。敲低實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步支持了之前的結(jié)果，即：Cytl1負(fù)調(diào)節(jié)MSCs的成骨作用而不影響其基礎(chǔ)MSC表型。

BrdU增殖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ad-Cytl1過(guò)表達(dá)或Cytl1重組蛋白處理的MSCs中增殖能力顯著提升，而shRNA介導(dǎo)的Cytl1敲低則抑制增殖。Cytl1上調(diào)表達(dá)增加了AKT和GSK3β的激活磷酸化從而促進(jìn)增殖，而用LY294002或Wortmannin處理（AKT特異性抑制劑）MSCs細(xì)胞劑量依賴(lài)性的消除了AKT對(duì)增殖的刺激作用。說(shuō)明：Cytl1通過(guò)AKT信號(hào)途徑促增值。

與未分化的hMSCs中的這些作用相反，在已經(jīng)骨生成分化的MSCs中過(guò)表達(dá)Cytl1（第3天和第7天）并不會(huì)影響AKT或GSK3β的磷酸化。然而，MTS檢測(cè)結(jié)果則顯示，在已經(jīng)成骨分化的hMSCs細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Cytl1細(xì)胞存活率顯著降低。在第7天和第14天，由于Cytl1在成骨分化的hMSC中過(guò)度表達(dá)，TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Cytl1的過(guò)表達(dá)顯著增加BAX的蛋白水平而不影響B(tài)CL2的蛋白水平。鑒于BAX/BCL2的比例決定了對(duì)細(xì)胞凋亡的易感性，BAX 蛋白水平的這種增加表明：Cytl1過(guò)度表達(dá)的成骨分化hMSCs細(xì)胞的活力降低，是凋亡增加所引起。此外還發(fā)現(xiàn)在成骨分化的hMSCs中Cytl1過(guò)表達(dá)顯著增加p53的蛋白水平，說(shuō)明是p53在這一過(guò)程中上調(diào)了凋亡蛋白BAX。

通過(guò)AKT抑制（LY294002或Wortmannin）或敲低BAX（特異性siRNA）的手段來(lái)評(píng)估成骨和Cytl1調(diào)節(jié)MSCs增殖和凋亡之間的聯(lián)系。發(fā)現(xiàn)AKT抑制不會(huì)影響Ad-Cytl1誘導(dǎo)的成骨抑制（茜素紅結(jié)果），表明AKT信號(hào)傳導(dǎo)不直接影響hMSCs的成骨，盡管它可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖來(lái)增加骨祖細(xì)胞的數(shù)量。相反，BAX的敲低顯著阻斷了Ad-Cytl1的成骨抑制作用，這清楚地表明Cytl1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的BAX上調(diào)對(duì)于Cytl1調(diào)節(jié)的MSCs成骨能力是必需的。

在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與WT同窩小鼠相比，Cytl1?/?基因敲除的小鼠骨小梁中TUNEL陽(yáng)性凋亡成骨細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。所有的結(jié)果都表明：Cytl1介導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)路徑在調(diào)節(jié)小鼠骨量中的重要作用。最后，作者還證明了Cytl1?/? 小鼠表現(xiàn)出的增加的骨量和對(duì)OVX（卵巢切除）誘導(dǎo)的骨吸收的抗性。并發(fā)現(xiàn)Cytl1?/? 小鼠中觀察到的骨量增加，是由破骨細(xì)胞生成減少和MSCs的成骨分化增加所導(dǎo)致。

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