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Tunel染色實操注意事項由普拉特澤生物——病理實驗平臺技術(shù)為大家總結(jié)分享。Tunel是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，能準(zhǔn)確地反映出細(xì)胞和組織凋亡的典型生物化學(xué)和形態(tài)特征，普拉特澤生物承接細(xì)胞、組織樣本細(xì)胞凋亡檢測外包幾百例，總結(jié)出操作過程中容易被實驗員忽略的注意事項，分享給大家：

1、Tunel檢測固定注意事項

（1）固定液建議使用4%的多聚甲醛（PBS）進(jìn)行固定，不建議選用乙醇和甲醇，也不能選用甲醛替代，因為市面上購買得到的甲醛大多含有甲醇。這會使我們后續(xù)的染色過程中標(biāo)記效率降低，難以觀察到熒光。

（2）固定液的濃度不可過高，濃度過高的固定液會使組織邊緣迅速固定，影響液體的穿透，影響固定效果，導(dǎo)致組織中心的細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂等情況的發(fā)生，實驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性。

（3）固定時間不可過長，太長的固定時間會影響試劑的染色效率。

2、Tunel檢測需充分脫蠟水化

脫蠟可以先 60°C 20 min，再用使用二甲苯兩次 5-10 min；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗，這些以便后面的結(jié)合反應(yīng)充分、均勻。

3、Tunel檢測孵育注意事項

一般根據(jù)切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時間，常用 10-30 min，幾 μm 切片用短時間；幾十 μm 切片用長時間，通過摸索達(dá)到既不脫片，又能夠使后面的酶和抗體進(jìn)入胞內(nèi)。實驗結(jié)果出現(xiàn)的假陽性也可能與Tunel染色孵育步驟有關(guān)，Tunel染色液孵育時間過長，可能會出現(xiàn)非特異性熒光。

4、適當(dāng)延長Tunel反應(yīng)液的時間

一般是37°c 1 h，也可以根據(jù)細(xì)胞凋亡損傷程度，選擇更長的時間，可長至 2 h，但要結(jié)合你最終的背景著色。

5、Tunel檢測操作避光

熒光在普通光照下不能長時間保持熒光，所以，在進(jìn)行需要避光操作的步驟時，我們要嚴(yán)格進(jìn)行避光操作，避免熒光淬滅導(dǎo)致不能對實驗結(jié)果有準(zhǔn)確判斷。

6、Tunel檢測輕柔操作

貼壁細(xì)胞在加藥誘導(dǎo)凋亡后，細(xì)胞狀態(tài)會發(fā)生改變，細(xì)胞形態(tài)皺縮邊緣，其貼壁粘附力降低。在對此細(xì)胞進(jìn)行實驗染色時，需要小心操作，避免吹打造成的細(xì)胞脫落，尤其是我們在對細(xì)胞的多次洗滌時操作更要小心輕柔。

7、Tunel檢測曝光注意事項

在進(jìn)行熒光顯微鏡觀察時，根據(jù)顯微鏡的不同，具體參數(shù)曝光時間建議在1000ms以內(nèi)，增益參數(shù)建議在500%以內(nèi)，或不開增益曝光時間控制再2000ms以內(nèi)，過度曝光也會增加實驗的假陽性。

好啦，Tunel染色操作時的注意事項咱們就介紹完啦，希望能夠在實際的操作中真正幫助到您，得到一個清晰漂亮好分辨的實驗結(jié)果。當(dāng)然您若是有Tunel染色實驗或細(xì)胞凋亡檢測外包與代做的需求的話，歡迎直接留言，普拉特澤生物隨時在線。

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