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        大家好，今天普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是TUNEL染色實驗的常見問題與解決方法。普拉特澤生物—病理實驗平臺承接了大量的TUNEL檢測細(xì)胞凋亡代測實驗與技術(shù)咨詢服務(wù)，同時在實操過程中也遇到了很多特殊的實驗結(jié)果，今天小編就把普拉特澤生物技術(shù)在用TUNEL檢測細(xì)胞凋亡時遇到的各種問題極其解決方法總結(jié)給大家，希望能在實驗的操作中給到大家一定的幫助！

        問題一、熒光信號弱或沒有熒光信號

   原因1：樣本處理不當(dāng)

        （1）樣本切片太厚。建議適當(dāng)將切片切薄一點，便于染色。

        （2）脫蠟和水化不充分。建議脫蠟先60 oC 20 min，再使用二甲苯兩次5-10 min；而水化用梯度乙醇從高到低濃度浸洗。

        （3）Proteinase K的孵育時間過短。優(yōu)化Proteinase K的孵育時間，常用時間10-30 min。4 μm左右的片子孵育10 min，30μm左右的片子孵育30 min。

        （4）Proteinase K濃度過低。建議蛋白酶K一般工作液濃度為20 μg/mL。

        （5）放置在-20 oC保存較長時間的切片不新鮮，減低染色效率。建議使用新鮮切片。

         原因2：染色操作不當(dāng)

        （1）染色時間過短。建議一般 37 °c 孵育60 min，可以根據(jù)凋亡損傷程度，可長至2 h，但要結(jié)合背景著色。

        （2）TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度過低。建議適當(dāng)提高TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度。

        （3）TdT酶失活。建議TUNEL反應(yīng)液臨用前配制，短時間在冰上保存。不宜長期保存，長期保存會導(dǎo)致TdT酶失活。

        （4）樣本干燥。加上TUNEL反應(yīng)液后，請蓋上蓋玻片/保鮮膜/濕盒中進(jìn)行，保證樣本均勻染色，又可防止反應(yīng)液干燥。

         原因3：熒光檢測操作不當(dāng)

        主要是因為操作未避光。由于熒光易碎滅，建議標(biāo)記與檢測樣本時，載玻片要避光，觀察時要盡量快。

        問題二、非特異性染色（假陽性高）

        原因1：樣本處理不當(dāng)

        （1）使用酸性或堿性固定液，導(dǎo)致DNA損傷。建議使用pH中性的固定液固定組織或者細(xì)胞。

        （2）固定液濃度過高，導(dǎo)致細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂、造成假陽性。建議使用4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）。

        （3）固定時間過長，導(dǎo)致細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂、造成假陽性。建議控制固定時間在4 ℃放置25 min。

        （4）蛋白酶K處理時間過長，破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽性。建議適當(dāng)縮短處理時間。

        （5）蛋白酶K濃度過大，破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽性。建議適當(dāng)調(diào)整蛋白酶K溶液濃度，一般工作液濃度為20 μg/mL。

        原因2：染色操作不當(dāng)

        （1）TUNEL染色時間過長。建議一般是 37 °c 孵育60 min，可以根據(jù)凋亡損傷程度，可長至2 h，但要結(jié)合背景著色。

        （2）未充分清洗樣本。染色后PBS清洗次數(shù)可增加到5次，來避免切片的非特異性染色。

        問題三、熒光背景強(qiáng)

        原因1：樣本操作不當(dāng)

        （1）TUNEL染色時間過長。建議染色時間適當(dāng)，一般是 37 °c孵育60 min，避免串色。

        （2）TUNEL染色液濃度過大。建議增大稀釋倍數(shù)，優(yōu)化濃度。

        （3）PBS未充分清洗樣本。在TUNEL反應(yīng)后PBS清洗次數(shù)可增加到5次，來避免切片樣本中殘留的染料。

        原因2：熒光檢測操作不當(dāng)

        曝光時間過長。建議調(diào)整曝光條件，先對陰性組調(diào)整到無背景光，然后用這個曝光條件去拍攝實驗組（可以微調(diào)，但是不需要大調(diào)）。

        
       好啦，那TUNEL染色的幾個常見問題咱們就介紹到這里啦，您還有遇到其他的問題，歡迎給我們留言，我們會回答后加到這片文章中跟大家一起學(xué)習(xí)哦！

        如果您有用TUNELl或流式代測細(xì)胞凋亡的需求的話，請相信——普拉特澤！