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        大家好，今天普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)一個新的實驗——TUNEL檢測。TUNEL染色實驗主要用來檢測細(xì)胞的凋亡，可以直觀地看到樣本細(xì)胞的凋亡情況，普拉特澤生物——病理實驗平臺專業(yè)提供TUNEL染色代做與檢測服務(wù)，實操過大量細(xì)胞與組織樣本的凋亡檢測，今天就跟大家一起來學(xué)習(xí)什么是TUMEL檢測吧！

        TUNEL染色是檢測細(xì)胞凋亡染色的常見方法，其原理是細(xì)胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細(xì)胞凋亡時抽提DNA進(jìn)行電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn)180~200bp的DNA ladder?；蚪MDNA斷裂時，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上熒光素、生物素標(biāo)記的dUTP，從而可以通過熒光顯微鏡或化學(xué)顯色方法檢測細(xì)胞凋亡的情況。

           Tunel檢測細(xì)胞凋亡的詳細(xì)操作方法如下：

            1.常規(guī)方法制作石蠟切片，用二甲苯浸洗2次，每次5 min;

            2.用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次，每次3 min;

            3.PBS漂洗2次用ProteinaseK工作液(20ug/ml)處理組織15-30 min，在21-37°C(溫度、時間、濃度均需摸索)或者加細(xì)胞通透液8 min;

            4.加入PBS，室溫反應(yīng)5 min，PBS漂洗2次

            5.制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50 ulTdT、450 ul熒光素標(biāo)計的dUTP液混勻，而陰性對照組僅加50 ul熒光素標(biāo)記的dUTP液，陽性對照組先加入100 ulDNase1，15~25℃x10 min反應(yīng)，后面步驟同處理組。

            6,玻片干后，用濾紙小心吸去切片周圍多余液體，加50 ulTUNEL反應(yīng)混合液（陰性對照組僅加50 ul熒光素標(biāo)記的dUTP液），于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃，1 h。

            7.加入到已預(yù)熱37 ℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液，37 ℃保溫30 min，PBS漂洗3次;

            8,可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數(shù)凋廣細(xì)胞(激發(fā)光波長為450~500 nm，檢測波長頭515~565 nm);

            9.玻片干后加50 ulDIG-POD干標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜，在暗漏盒中反應(yīng)37℃，30 min.

            10.PBS漂洗3次；在組織外加50~100uIDAB底物，反應(yīng)15~25C，10 min:

            11.PBS漂洗3次；拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

            12.加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞(共計200~500個細(xì)胞)并拍照。

            可結(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來綜合判斷(未染色細(xì)胞變小、胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象；晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化、核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體)

             好啦，那關(guān)于細(xì)胞凋亡實驗的原理與操作步驟我們就介紹到這里啦，如果您還有更多的問題歡迎隨時給客服留言，有更多tunel染色代做與細(xì)胞實驗外包的需求也可直接留言，普拉特澤會及時回復(fù)~