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     大家好！今天普拉特澤生物繼續(xù)跟大家一起整理了這些疑問部分，希望和大家交流學習~

WB實驗(Western Blot，蛋白質(zhì)印跡)是一種用于檢測特定蛋白質(zhì)在復雜樣品中存在及其相對表達量的分子生物學技術其主要步驟為:樣品制備→電泳→轉膜→封閉→抗體孵育→>檢測(顯影和成像)

——常見疑問合集

一.Marker
1.什么是Marker ?

Marker是蛋白分子量標準，一些已知分子量的蛋白質(zhì)的混合物，用于指示蛋白質(zhì)條帶的大小?？梢灶愃茷橐话选俺咦印保炞C目的蛋白的分子量。

2.Marker的作用是什么?

①指示待測蛋白分子量

②顯示蛋白在凝膠上的電泳進度
③可協(xié)助標記加樣順序4)判斷轉膜效率

④判斷轉膜效率

3.Marker的分類

①未預染Marker:

優(yōu)點:非預染蛋白沒有附帶染料分子或標記分子，指示大小正好是蛋白原本的大小，所以最準確。

缺點:非預染蛋白Marker在電泳過程中看不到，電泳結束后經(jīng)過蛋白染色后才能起指示作用，無法在實驗過程中起預示作用。

②預染Marker:(wb常用)

優(yōu)點:肉眼看見，可直接觀察電泳進程和轉膜是否完全，較為常用。

缺點:Marker蛋白跟染料共價偶聯(lián)導致蛋白分子電泳的遷移效率發(fā)生改變，其指示的分子量不是精確值而有一定誤差。

3 曝光Marker.

在曝光步驟中，可將目的條帶和Marker條帶同時曝光顯示，減小誤差，并克服了但克服了預染 Marker 遷移率的改變，但價格昂貴

4.預染Marker的選擇:

①分子量范圍

蛋白marker分為低分子量，寬分子量，高分子量幾類。根據(jù)需求選擇

②質(zhì)量和穩(wěn)定性

③與膜的親和性

二.轉膜

1.轉膜的原理

將凝膠中分離的蛋白質(zhì)轉移到與其具有高度親和力的膜上(一般常用pvdf膜)，使蛋白后續(xù)更容易與抗體結合，便于后續(xù)抗體檢測。

原理:利用電場使帶負電的蛋白質(zhì)從凝膠向正極移動，最終附著在膜上。

2.轉膜過程中甲醇的作用

轉膜液中甲醇的作用∶

① 增強蛋白質(zhì)與膜的結合

甲醇能去除蛋白質(zhì)表面的SDS，使蛋白質(zhì)更容易與膜(如PVDF或硝酸纖維素膜)結合，提高轉膜效率。

② 防止凝膠膨脹

結合，提高轉膜效率。

② 防止凝膠膨脹

甲醇能防止凝膠過度吸水膨脹，保持凝膠結構穩(wěn)定，確保蛋白質(zhì)有效轉移。

③甲醇能改善蛋白質(zhì)從凝膠向膜的轉移,特別是對高分子量蛋白質(zhì)效果顯著。

甲醇激活PVDF膜的作用:

①用甲醇激活PVDF膜，可以將膜從疏水性變?yōu)橛H水性,提高膜對蛋白質(zhì)的吸附能力。

②甲醇可以減小膜的孔徑，讓PVDF膜的孔徑變小，防止小分子量蛋白質(zhì)在轉膜過程中丟失。

三.封閉

1.孵育一抗體前為什么需要用脫脂牛奶封

閉?

膜具有高蛋白結合能力，可以結合任何可用的蛋白，包括用于檢測的抗體。如果不進行封閉處理，抗體可能會非特異性地結合到膜上未被樣品蛋白占據(jù)的位置，導致高背景信號

合到膜上未被樣品蛋白占據(jù)的位置，導致高背景信號。

封閉的作用

①減少非特異性背景:封閉劑通過占據(jù)空白位點，阻止抗體非特異性結合，從而降低背景噪音，使條帶更清晰。

②增強特異性信號:有效的封閉可以幫助抗體更專一地結合到其目標蛋白，提高檢測的特異性。

(脫脂牛奶是最常用的封閉劑，成本低廉且富多種蛋白。但不宜用于磷酸化蛋白檢測，磷酸1蛋自盡量使用BSA)

四.孵育抗體

1.一抗二抗的原理，為什么需要使用二抗?

原理

一抗的作用是特異性識別目標蛋白的某個抗原表位，這個過程是由一抗的可變區(qū)(Fab區(qū))完成的。二抗識別并結合一抗的恒定區(qū)(Fc區(qū))，而不是目標蛋白本身

2..為什么需要使用二抗？

①二抗可以通用

同一種動物來源的抗體恒定區(qū)是相同的,因此只需要制造一種通用的二抗(如抗免二抗)就可以用于所有由免子產(chǎn)生的一抗，無論這些一抗識別的是哪種蛋白。②放大信號

一個一抗可以結合多個二抗，多個二抗的結合帶來了更多的信號分子，從而增強目標蛋白的信號。

3..稀釋一抗二抗一般使用什么液體?                      

因此只需要制造一種通用的二抗（如抗兔二抗），可以用于所有由兔子產(chǎn)生的一抗

3.一抗二抗一般使用什么液體 ?

二抗稀釋配方：PBST/TBST+5% BSA（血清白蛋白），比例 1:5000~60000           

(Tween-20可以幫助稀釋的二抗均勻分散，并提高其與目標蛋白的結合。

BSA可以作為阻斷劑，降低非特異性結合，提高實驗的特異性）

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