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Transwell實(shí)驗(yàn)介紹由普拉特澤生物品臺(tái)總結(jié)分享，細(xì)胞檢測(cè)平臺(tái)為廣大科研實(shí)驗(yàn)人員提Transwell外包實(shí)驗(yàn)服務(wù)，先一起來學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)Transwell檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

一、實(shí)驗(yàn)原理

侵襲是Transwell實(shí)驗(yàn)的一種，可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響。將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，小室底部鋪了一層聚碳酸酯膜相隔。聚碳酸酯膜上室側(cè)鋪上一層基質(zhì)膠，用以模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞欲進(jìn)入下室，先要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠降解，方可通過聚碳酸酯膜。通過結(jié)晶紫然后后測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)值可反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

二、實(shí)驗(yàn)通用儀器及試劑

   1.主要儀器

2. 主要試劑

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 細(xì)胞復(fù)蘇

(1)     將ddH₂O預(yù)溫至37℃。

(2)     戴上手套和口罩帽子，從液氮罐中取出裝有目的細(xì)胞的凍存管（內(nèi)有1 mL細(xì)胞混合液），立即投入37℃ ddH2O中，輕搖凍存管使之在1分鐘內(nèi)快速溶解。

(3)     完全溶解后，75%酒精擦拭凍存管外壁消毒后帶進(jìn)超凈臺(tái)。

(4)     在超凈臺(tái)中，在15 mL滅菌離心管中預(yù)先加入10 mL新鮮配制的培養(yǎng)基，打開凍存管，將所有凍融的細(xì)胞懸液加入該離心管中，常溫1000 rpm離心3分鐘，吸除上層的培養(yǎng)液。

(5)     1mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻后加入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)基至5 mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

(6)     48小時(shí)后換液，細(xì)胞融合接近80%時(shí)即可傳代。

2. 細(xì)胞預(yù)處理

MDA-MB-231細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃飽和濕度、含5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染

(1)     鋪板：處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6cm皿中，根據(jù)細(xì)胞大小和形狀調(diào)整接板細(xì)胞量。

(2)     培養(yǎng)：37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長(zhǎng)至50%~60%匯合度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

(3)     質(zhì)粒和脂質(zhì)體準(zhǔn)備：用500 μL的不含血清的培養(yǎng)基孵育8μg的質(zhì)粒；500 μL的不含血清的培養(yǎng)基孵育16μL的 Lipo3000，靜置5 min；將含質(zhì)粒和含有脂質(zhì)體的培養(yǎng)基混合，混勻后室溫靜置20 min。

(4)     棄去板中原有培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基，加入混合液，4-6 h后換含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

4.侵襲實(shí)驗(yàn)

(1)     用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，小室室各加100 μL（20-30 μg/孔），放入37℃培養(yǎng)箱中待其凝固，出現(xiàn)“白色層”取出小室。

(2)     轉(zhuǎn)染48 h后分別消化收集各組細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

(3)     取出小室，加入500 μL無血清培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中。

(4)     吸掉已充分浸潤(rùn)基底膜后的侵襲小室內(nèi)的培養(yǎng)基。

(5)     加500 μL的含有10% FBS的培養(yǎng)基至下室（侵襲小室外，24孔板孔內(nèi)）；加300 μL已調(diào)節(jié)好細(xì)胞密度的細(xì)胞懸液（5×10⁴個(gè)）至侵襲小室內(nèi)；置于37℃、5% CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱48 h。

(6)     取出小室，用4%多聚甲醛固定20 min，用棉簽輕柔擦拭以去除侵襲小室內(nèi)未侵過基底層膜的細(xì)胞，以及基底層（Matrixgel），小心操作以免刺穿底層聚碳酸酯膜。

(7)     在新的24孔板孔中加500 μL結(jié)晶紫，分別將侵襲小室浸入染色10 min。

(8)     用PBS沖洗掉侵襲小室上多余的染料，置于空氣中干燥。

(9)     100倍顯微鏡拍照，再用PS進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算各孔的穿過去的細(xì)胞數(shù)量。

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