上個月為大家分享了一篇《Nature Communications》中的單細胞文章，今天小編再給大家提供一個單細胞研究案例，對照兩年內(nèi)同水平文章內(nèi)容深度變化，可以發(fā)現(xiàn)目前僅憑單細胞測序要想出高分文章已經(jīng)不夠了，需要增加研究深度及實用性，但從細胞層面來揭示和攻克疑難科學(xué)問題仍是未來研究的熱門趨勢，也是治療疑難雜癥的理論基礎(chǔ)。本研究案例為多院校合作研究團隊從細胞水平揭示了：睪丸支持細胞發(fā)育路徑及其在非梗阻性無精子癥（NOA）中的重要作用。為治療男性不育問題帶來了新的思路。
論文鏈接：110.1038/s41467-020-19414-4
非梗阻性無精子癥（NOA）是男性不育的最嚴重的形式，發(fā)生在10-15%的不育男性中。然而，僅有少部分是由先天因素造成的，大部分是由未知原因引起，也被稱為特發(fā)性NOA（iNOA），占70%以上，盡管通過手術(shù)后可以在iNOA患者中發(fā)現(xiàn)精子，但成功率極低。
精子發(fā)生取決于體細胞微環(huán)境的完全成熟，因此對NOA患者進行有效的病因分析和治療，就需要充分了解體細胞微環(huán)境中細胞的變化情況。作者對10名不同年齡段的健康組和7名NOA患者組進行了8萬個睪丸細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，揭示了不同NOA支持細胞的病理變化和成熟障礙，還獲得了Wnt信號通路調(diào)節(jié)正常和NOA支持細胞成熟的證據(jù)，為生精微環(huán)境的成熟和發(fā)病機制提供了深入的見解，也為臨床NOA的診斷方法和治療靶點提供了新的思路。
研究者從10名生精正常樣本（嬰兒到成年）和7名NOA患者共獲得88723個睪丸細胞，每個細胞平均檢測到2719個基因（圖1a-c）。對正常不同年齡段與不同NOA患者睪丸細胞UAMP分析（圖d-f）及細胞差異度分析（圖1g），正常成人和三種NOA患者的支持細胞最為顯著，表明NOA患者的體細胞微環(huán)境的變化主要發(fā)生在支持細胞中。因此睪丸支持細胞可能影響著NOA的發(fā)生。
圖1嬰兒期至成年期和NOA患者的人類睪丸細胞的整體表達譜分析
二、睪丸支持細胞經(jīng)歷了三個不同的連續(xù)發(fā)育階段
研究者對10個生精正常供體的支持細胞進行重聚類和擬時序分析，睪丸支持細胞的增殖、能量代謝等表明支持細胞經(jīng)歷了3個不同的連續(xù)發(fā)育階段（圖2a-b）。隨著年齡的增長，Stage_a占比逐漸降低，Stage_b占比逐漸增加，青春期時期Stage_c出現(xiàn)，在青春期后期發(fā)育至穩(wěn)定狀態(tài)（圖2c）。通過差異基因分析（圖2d）、功能富集分析（圖2e）及免疫組化在蛋白層面的驗證（圖2f），還發(fā)現(xiàn)睪丸支持細胞的主要功能與生殖細胞及其代謝物清除有著密切聯(lián)系。
圖2 支持細胞3個發(fā)育階段的鑒定
三、睪丸支持細胞成熟的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解釋
通過IPA結(jié)果表明從Stage_a到Stage_b過程中細胞增殖相關(guān)信號被抑制，上皮細胞粘附分子連接的重塑信號被激活；從Stage_b到Stage_c過程中Wnt/β-連環(huán)蛋白信號被抑制，而生殖細胞-支持細胞連接信號等被激活（圖3a-b），表明支持細胞的增殖發(fā)生在Stage_a，結(jié)構(gòu)重塑發(fā)生在Stage_b，揭示了支持細胞成熟的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
圖3 支持細胞3個發(fā)育階段的推斷信號通路
四、iNOA患者成熟缺陷的相關(guān)信號的揭示
通過UMAP分析顯示支持細胞可分為三個亞群，即cluster1-2（iNOA支持細胞組成）和cluster 3（健康成人支持細胞），且發(fā)現(xiàn)cluster1與的Stage_a相似，cluster2與的Stage_b相似（圖4a-b）。通過IPA分析Wnt通路在cluster1-2中被激活，而正常支持細胞中Wnt細胞通路被抑制（圖4c-d）。因此，推測Wnt通路的異常激活導(dǎo)致iNOA支持細胞的成熟缺陷。
圖4 iNOA支持細胞的異質(zhì)性和成熟停滯
通過對來自iNOA病人和正常支持細胞進行了體外培養(yǎng)，并添加不同的Wnt信號通路抑制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制劑ICG顯著降低了iNOA和正常支持細胞的增殖（圖5a）；通過探究不同處理的支持細胞對生殖細胞的影響發(fā)現(xiàn)ICG可促進生殖細胞的增殖（圖5b-c）。因此，抑制Wnt途徑可有效緩解iNOA支持細胞的成熟障礙并促進生殖細胞的正常功能。
圖5 抑制Wnt通路可體外誘導(dǎo)支持細胞的成熟
該研究通過分析不同年齡正常人類和NOA患者的單細胞轉(zhuǎn)錄組，不僅揭示了正常睪丸中主要細胞類型及其成熟過程，發(fā)現(xiàn)了支持細胞經(jīng)歷三個獨立且連續(xù)的發(fā)育階段（Stage_a、Stage_b和Stage_c），還通過比較主要類型NOA患者睪丸細胞的成熟障礙揭示了不同類型NOA的發(fā)病機制，還發(fā)現(xiàn)了抑制Wnt途徑可有效緩解iNOA支持細胞的成熟障礙并促進生殖細胞的正常功能。為進一步研究睪丸支持細胞的發(fā)育提供了理論基礎(chǔ)，為開發(fā)NOA的診斷和治療方法鋪平了道路。
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2023-07-24 13:55:04
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