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細(xì)胞增殖檢測(cè)常用技術(shù)的原理及操作【附視頻教程】

細(xì)胞增殖是活細(xì)胞的重要生理功能之一，是生物體的重要生命特征，是生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖以及遺傳的基礎(chǔ)，是腫瘤研究的重要表型之一，同時(shí)也是分子生物學(xué)和藥理學(xué)研究解決問(wèn)題的關(guān)鍵。通過(guò)在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或干擾某個(gè)基因研究基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響，進(jìn)一步研究基因的功能，或?qū)?xì)胞進(jìn)行藥物處理，研究藥物對(duì)增殖的影響。

細(xì)胞增殖檢測(cè)通常是基于DNA含量或細(xì)胞代謝實(shí)現(xiàn)的，主要為對(duì)活細(xì)胞的代謝活性的檢測(cè)(基于WST、MTS、XTT、MTT等)及對(duì)DNA合成的檢測(cè)(基于BrdU的免疫法或EdU的點(diǎn)擊化學(xué)法)；同時(shí)也可通過(guò)體內(nèi)成像、微孔板或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)等多種技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞追蹤。

那么我們使用藥物時(shí)評(píng)估毒性、篩選抗腫瘤、判斷細(xì)胞增殖速度或者探究某些基因蛋白的功能時(shí)，就可以通過(guò)細(xì)胞增殖來(lái)反映。今天主要給大家介紹活細(xì)胞代謝檢測(cè)中應(yīng)用的比較廣泛的MTT、MTS和CCK8這三類方法。

一、細(xì)胞增殖檢測(cè)的原理

1、MTT法

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

2、MTS法

原理與MTT相近，屬于在MTT基礎(chǔ)上的改良，含有一個(gè)新型的四唑化合物和一種電子偶聯(lián)劑（ｐｈｅｎａｚｉｎｅ?。澹簦瑁铮螅酰欤妫幔簦?，PES），PES具有增強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性，這使它可與MTS混合形成穩(wěn)定的溶液。MTS被細(xì)胞生物還原成為一種有色的甲臜產(chǎn)物，可直接溶解于培養(yǎng)基中。這種轉(zhuǎn)化是在代謝活躍的細(xì)胞中的脫氫酶產(chǎn)生的NADPH或NADH的作用下完成的。避光孵育3h后，在492nm處有一個(gè)最大的吸收峰，檢測(cè)到的甲臜產(chǎn)物的量與培養(yǎng)中的活細(xì)胞數(shù)成正比。

3、CCK8法

在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy?PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物。生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。

二、細(xì)胞增殖檢測(cè)常用技術(shù)的聯(lián)系與區(qū)別

為了讓大家更直觀的了解到這三種檢測(cè)方法的聯(lián)系與區(qū)別，我們采用了列表的方法：

三、細(xì)胞增殖檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)操作步驟

1、細(xì)胞培養(yǎng)：觀察細(xì)胞的增長(zhǎng)特性（細(xì)胞形態(tài)、增長(zhǎng)速度等）

2、鋪板：鋪板密度建議5*103~10*103/孔，在操作臺(tái)靜置10分鐘，有利于細(xì)胞的自由沉降，鋪板更加均勻

3、培養(yǎng)細(xì)胞：將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中，至細(xì)胞貼壁且狀態(tài)穩(wěn)定

4、藥物處理：棄培養(yǎng)基，更換含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)（注意要過(guò)濾之后再使用，且要現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍融）

5、MTT呈色:避光加1/10體積MTT溶液(5 mg/mL)，37℃孵育4 h，孵育完成后除盡孔內(nèi)上清液，每孔加150 uL DMSO，振蕩10 min;

或MTS呈色:避光加1/10體積MTS溶液，37℃孵育3h;

或CCK8呈色:避光加1/10體積CCK-8溶液，孵育37℃1-4h;

6、上機(jī)檢測(cè)OD490nm/492 nm/450 nm值

四、細(xì)胞增殖培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

這三種方法最后的結(jié)果是以細(xì)胞相對(duì)存活率或IC₅₀這兩個(gè)指標(biāo)呈現(xiàn)：

1、細(xì)胞相對(duì)存活率%=(處理組OD值-調(diào)零孔OD值)/(對(duì)照組OD值-調(diào)零孔OD值)*100

2、IC5計(jì)算：指某一藥物或者物質(zhì)(抑制劑)在抑制某些生物程序(如酶、細(xì)胞受體、是微生物)的半量，即50%抑制濃度

五、細(xì)胞增殖檢測(cè)的注意事項(xiàng)

當(dāng)您根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)情況選擇了合適的檢測(cè)方法的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果還是不理想，問(wèn)題出在哪呢？

我們?yōu)槟砹艘韵聦?shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)，希望能對(duì)您有所幫助：

1 、鋪板

細(xì)胞數(shù)量：在前期細(xì)胞培養(yǎng)中，觀察細(xì)胞貼壁率、貼壁后面積大小、倍增時(shí)間，以確保處理過(guò)程中不會(huì)細(xì)胞過(guò)滿（鋪板太密或長(zhǎng)太久，細(xì)胞都會(huì)擠死掉的！），準(zhǔn)確呈現(xiàn)處理因素與細(xì)胞數(shù)的關(guān)系（5×103 ~10×103 ）。意思就是先了解下你需要檢測(cè)的細(xì)胞，做個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)先。

2、避免血清的干擾

用含胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，高濃度血清物質(zhì)（我也會(huì)吸光噠！）會(huì)影響試驗(yàn)孔的吸光度值，降低實(shí)驗(yàn)敏感度。

3、防止邊緣效應(yīng)及復(fù)孔設(shè)置

應(yīng)在96孔板邊緣滴加PBS，邊緣孔的水分揮發(fā)較快，藥物易被濃縮，對(duì)實(shí)驗(yàn)影響很大大。復(fù)孔，做3-5個(gè)，推薦5個(gè)（別省那點(diǎn)板子?。。?/span>

細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)你弄混了嗎點(diǎn)此跳轉(zhuǎn)

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