15種蛋白互作研究方法的原理及優(yōu)缺點！
2026-02-28 16:10:01
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺
常見的蛋白互作研究方法有哪些呢？
本篇文章為大家整理了15種蛋白互作研究方法，快來看看吧~
一、融合蛋白沉降技術(shù)（Pull-down）
原理：通過磁珠/瓊脂糖填料固定帶有標(biāo)記的“誘餌”蛋白，從細(xì)胞裂解液、純化蛋白或表達(dá)系統(tǒng)中捕獲“獵物”蛋白，然后將復(fù)合物蛋白分離后進(jìn)行凝膠或質(zhì)譜分析，從而確認(rèn)互作蛋白的“身份”。
優(yōu)點：不僅能證實靶蛋白的直接相互作用，且洗脫條件也很溫和，保留蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與天然蛋白復(fù)合體的同時，又避免將非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)共同洗脫下來，確保了后續(xù)分析的準(zhǔn)確性。
缺點：易出現(xiàn)假陽性；不能夠完全反映細(xì)胞內(nèi)蛋白真實互作的狀態(tài)；融合表達(dá)的GST標(biāo)簽，肽鏈較長，可能會改變原目的蛋白的原有的折疊結(jié)構(gòu)。
二、串聯(lián)親和純化技術(shù)（TAP）
原理：傳統(tǒng)的TAP標(biāo)簽蛋白由Protein A、TEV蛋白酶可剪切序列和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（CBP）組成。
TAP技術(shù)通過兩步親和純化來減少非特異性蛋白結(jié)合。 優(yōu)點：TAP能減少非特異性蛋白結(jié)合，還能保留蛋白復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的修飾和結(jié)合狀態(tài)。
缺點：需要較多的樣本材料來提取蛋白，價格比較昂貴，不能高效檢測到瞬時或較弱的蛋白質(zhì)相互作用。
三、生物膜干涉技術(shù)（BLI）
原理：是一種無標(biāo)記（Label-free）光學(xué)生物傳感技術(shù)，用于實時監(jiān)測分析生物分子相互作用，并對其結(jié)合強(qiáng)度和動力學(xué)進(jìn)行量化分析。與SPR技術(shù)不同的是，BLI技術(shù)中不使用金屬芯片，而是利用生物傳感器。將配體偶聯(lián)在傳感器的末端，浸入樣品中來捕獲分析物。 優(yōu)點：易于使用；幾乎無堵塞，適用于復(fù)雜、粘稠的樣本；可最大限度地減小了體積效應(yīng)。 缺點：傳感器的靈敏度比SPR和GCI傳感器低幾個數(shù)量級；確定動力學(xué)參數(shù)時，精度有限
四、表面等離子共振技術(shù)（SPR）
原理：在芯片表面固定一層生物分子識別膜，然后將待測樣品流過芯片表面，若樣品中有能夠與芯片表面的生物分子識別膜相互作用的分子，會引起金膜表面折射率變化，最終導(dǎo)致SPR角變化，通過監(jiān)測SPR的角度變化，獲得被分析物的濃度、親和力、動力學(xué)常數(shù)和特異性等。
優(yōu)點：檢測快捷方便，應(yīng)用范圍廣、不需要標(biāo)記待測物。
缺點：對于樣品組成以及溫度等干擾因素比較敏感，對于非特異性吸附比較難區(qū)分。
五、光柵耦合干涉技術(shù)（GCI）
原理：基于波導(dǎo)干涉技術(shù)（另一種無標(biāo)記的光學(xué)分析方法），可以實時監(jiān)測和表征分子相互作用，并確定動力學(xué)速率參數(shù)、親和常數(shù)以及與固定配體相互作用的分析物分子的濃度。
優(yōu)點：初級靈敏度，適用于無標(biāo)記的相互作用分析；無堵塞微流體；可以測量緊密結(jié)合劑和快速結(jié)合速率。
缺點：暫無
六、鄰近蛋白標(biāo)記技術(shù)（BioID）
原理：通過將生物素連接酶（BirA）與“誘餌”蛋白融合表達(dá)，加入適量生物素，融合蛋白的相互作用以及附近環(huán)境中的蛋白質(zhì)會被生物素化。然后通過鏈霉親和素或Strep-Tactin進(jìn)行親和純化，將被生物素化的蛋白質(zhì)從細(xì)胞裂解液中富集出來，產(chǎn)物做質(zhì)譜鑒定。
優(yōu)點：BiolD鑒定到的互作蛋白是細(xì)胞內(nèi)與誘餌蛋白天然互作的，符合體內(nèi)真實生理情況，可信度高；弱結(jié)合蛋白和瞬時互作蛋白也能被檢測到。
缺點：不能判斷鑒定到的蛋白是直接還是間接與誘餌蛋白互作的，而沒有伯胺的互作蛋白因不能被生物素化，所以無法被檢測到。
七、酵母雙雜交技術(shù)（Y2H）
原理：很多真核生物的轉(zhuǎn)錄因子由兩個有不同功能的結(jié)構(gòu)域組成，包括轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（Transcriptional activationdomain，AD）和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNAbinding domain，BD）。轉(zhuǎn)錄因子通過BD和九、噬菌體展示技術(shù)（PDT）AD分別與DNA上的特異序列結(jié)合，從而啟動相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。
優(yōu)點：簡便、易用、費用低廉，能檢測到瞬時或較弱的蛋白質(zhì)相互作用。
缺點：較高的假陽性，不能真實反映蛋白質(zhì)在自身細(xì)胞中的相互作用。
八、免疫共沉淀技術(shù)（Co-IP）
原理：以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，也是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。
優(yōu)點：保留蛋白質(zhì)的修飾和結(jié)合狀態(tài)，同時所需的樣本量較少。
缺點：Co-IP特異性較低。
九、噬菌體展示技術(shù)（PDT）
原理：在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當(dāng)噬菌體生長時，表面就表達(dá)出相應(yīng)的單抗，再將噬菌體過柱，柱上若含目的蛋白，就會與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合。
優(yōu)點：具有簡便、高通量的特點，可以直接評價相互結(jié)合的特異性。
缺點：不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達(dá)，因部分蛋白質(zhì)功能的實現(xiàn)需要折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、膜插入和絡(luò)合，導(dǎo)致在體內(nèi)篩選時需外加選擇壓力。
十、鄰位連接技術(shù)（PLA）
原理：采用核酸適體（aptamer）或單/多克隆抗體-寡聚核苷酸復(fù)合物作為鄰位連接探針（proximity probes）。當(dāng)一對鄰位探針同時識別同一個目標(biāo)蛋白分子（一個蛋白復(fù)合體中的兩個蛋白）時，它們將在空間位置上相互臨近，通過連接反應(yīng)形成可擴(kuò)增的DNA標(biāo)簽序列，該標(biāo)簽序列能夠反映待測蛋白的表達(dá)及互作情況。
優(yōu)點：可識別同一目標(biāo)的兩個不同抗原表位，靈敏度和精確度遠(yuǎn)高于單個表位識別；通過一對鄰位探針環(huán)化并且進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，更有利于信號的放大；可以憑借探針錨定目標(biāo)蛋白，從而準(zhǔn)確地定位目標(biāo)；可以捕獲瞬時的相互作用和低豐度蛋白的相互作用。
缺點：暫無一
十一、NanoBiT 蛋白互補(bǔ)技術(shù)
原理：利用兩個特定的互補(bǔ)蛋白質(zhì)片段，在相互作用后形成一個完整的蛋白質(zhì)復(fù)合物。其中，一個蛋白質(zhì)片段被稱為“受體”，另一個蛋白質(zhì)片段被稱為“配體”。當(dāng)兩個互補(bǔ)的蛋白質(zhì)片段相互接近時，它們會通過非共價相互作用結(jié)合在一起，形成一個穩(wěn)定的復(fù)合物。
優(yōu)點：高度特異性、強(qiáng)大的親和力以及靈活的應(yīng)用。
缺點：早期需要摸索LgBiT和SmBiT構(gòu)建在不同的N端或C端的組合。
十二、抗體與蛋白質(zhì)陣列技術(shù)
原理：以蛋白質(zhì)分子作為配基（探針蛋白），將其有序地固定在固相載體（滴定板、濾膜、玻璃片等）的表面形成微陣列；用帶有熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)（或其它分子）與之作用，經(jīng)漂洗將未結(jié)合的成分洗去，經(jīng)熒光掃描等監(jiān)測方式測定芯片上各點的熒光強(qiáng)度。然后通過熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系。
優(yōu)點：具有微量化、高通量、高靈敏度的特點；樣品要求低，可直接對不經(jīng)處理的各種體液和分泌物進(jìn)行檢測。
缺點：成本過高，需一系列昂貴的精密儀器；芯片的標(biāo)準(zhǔn)化問題。
十三、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）
原理：在兩個熒光發(fā)色基團(tuán)（如供體熒光基團(tuán)“CFP”和受體熒光基團(tuán)“YFP”）在足夠靠近時，供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移。
優(yōu)點：能檢測到瞬時、較弱的蛋白質(zhì)相互作用，以及倆蛋白的細(xì)胞分布和作用位點。
缺點：光譜可能存在重疊，影響實驗結(jié)果。
十四、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（BIFC）
原理：熒光蛋白可從特定的位點被分開，產(chǎn)生兩個非熒光活性片段。當(dāng)兩片段分別被融合到相互作用的蛋白上時，會因蛋白的相互作用力而被拉近、發(fā)生互補(bǔ)從而重新構(gòu)建成有活性的熒光蛋白并在激發(fā)光下產(chǎn)生熒光。因此可以直接通過觀察熒光有無來判斷蛋白是否發(fā)生相互作用。
優(yōu)點：能簡單方便地通過觀察熒光鑒定蛋白質(zhì)相互作用。
缺點：對溫度敏感，不能實時反應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)合和分離情況。
十五、生物發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)（BRET）
原理：一種流行的基于鄰近的檢測方法，即將一種目標(biāo)蛋白與生物發(fā)光能量供體融合，其他蛋白質(zhì)與熒光能量受體融合，可監(jiān)測活體內(nèi)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和構(gòu)象重排細(xì)胞。
優(yōu)點：不依賴于激發(fā)光，檢測背景低；不需要漂白，細(xì)胞損壞更少；同時也避免了自發(fā)熒光干擾。
缺點：需要配對的底物貴
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