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KO細胞株的構(gòu)建介紹由普拉特澤生物特色服務平臺總結(jié)分享，特色服務平臺為廣大科研實驗人員提供ko技術(shù)服務、蛋白原核表達服務、TSA技術(shù)服務先一起來學習學習如何構(gòu)建出KO細胞——
基于CRISPR/Cas9的原理，在細胞中轉(zhuǎn)染cas9/gRNA表達載體后，cas9-gRNA表達并切割，此時細胞分為四種：轉(zhuǎn)染陰性、轉(zhuǎn)染陽性（未被編輯、被編輯但未成功敲除、成功敲除）；通過抗性可篩選出轉(zhuǎn)染陽性細胞，但不能篩選出成功敲除的細胞，所以需要通過篩選單克隆得到成功敲除的細胞～

1.在轉(zhuǎn)病毒的前一天將目的細胞鋪到 12孔板，以第二天密度達 30-50%為宜(鋪板的時候種梯度密度，第二天選取密度合適的孔)3.轉(zhuǎn)病毒:棄舊培養(yǎng)基，更換新的完全培養(yǎng)基，將病毒液解凍后加入孔板，輕輕搖勻使病毒液均勻分布

2.病毒感染 24h 后撤掉病毒液，換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1天5.將孔板內(nèi)細胞轉(zhuǎn)入 T25 培養(yǎng)瓶,并加入對應抗性的藥物(嘌呤、G418、潮霉素等)篩選轉(zhuǎn)染陽性的細胞

3.根據(jù)細胞生長情況篩選 3-7天，鋪板提蛋白驗證混合克隆的敲低效率，同時收細胞 DNA 進行sanger 測序，根據(jù)測序結(jié)果和混合克隆敲低效率，選擇兩個片段(一般會有三個SgRNA)篩選單克隆細胞7.單克隆篩選:a.流式分選:提前在96孔板加好100mL/孔培養(yǎng)基，將細胞消化后上機分選即可，一個液滴只有一個細胞

b.極限稀釋法:將細胞消化后計數(shù)，取200個細胞制備細胞懸液(100mL培養(yǎng)基中含有一個細胞)，取100L/孔接種于96孔板8.挑選單克隆細胞:96 孔板培養(yǎng)1-2周后顯微鏡下挑選出單個細胞克隆的孔，做好標記并補加100mL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1周左右(培養(yǎng)時間視細胞生長情況而定)

4.篩選與鑒定:將96孔板內(nèi)單克隆細胞消化至12孔板，長滿后將細胞消化，取1/3至6孔板保種，2/3接種至另一個6孔板用于提蛋白鑒定目的基因是否成功敲除

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