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早期乳腺癌的癥狀多不明顯，晚期乳腺癌可發(fā)生癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)全身多器官病變，直接威脅患者的生命。目前，患乳腺癌后的骨轉(zhuǎn)移是乳腺癌高死亡率的主要原因（70%占比），那是否有方法通過調(diào)節(jié)免疫特性，去減少轉(zhuǎn)移性生長呢？這篇發(fā)表于Cancer Research上的文章就為大家做了詳細(xì)的講解~

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結(jié)論：

作者揭示了ERRα通過增加骨微環(huán)境的免疫活性來抑制乳腺癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中ERRα的過表達(dá)誘導(dǎo)趨化因子CCL17和CCL20的表達(dá)，并抑制轉(zhuǎn)化生長因子β3（TGF-β3）的產(chǎn)生。隨后，募集到骨轉(zhuǎn)移的CD8 + T淋巴細(xì)胞逃脫了TGF-β信號(hào)的控制，并具有加劇的細(xì)胞毒性特征，從而大大減少了轉(zhuǎn)移。作者在小鼠中發(fā)現(xiàn)的臨床相關(guān)性在240多名乳腺癌患者中得到了證實(shí)。因此，這項(xiàng)研究表明，ERRα調(diào)節(jié)骨骼微環(huán)境中的免疫特性，有助于減少轉(zhuǎn)移性生長。

正文解讀

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Fig1：在晚期乳腺癌中過表達(dá)ERRα模型抑制骨轉(zhuǎn)移發(fā)育

作者首先將4T1-CT；4T1-ERRα；4T1-CT（af2）；4T1-ERRαAF2細(xì)胞接種到BALB / c小鼠中。接種后13-15天，分析溶骨性病變。圖A~G為4T1-CT與4T1-ERRα對(duì)照組。圖H~N為4T1-CT（af2）與4T1-ERRαAF2對(duì)照組。

圖1 A：CT拍照，溶骨區(qū)用虛線劃分。

圖1 B：骨溶解顯示溶骨性病變的平均大小。

圖1 C、D：脛骨的矢狀切面(C)和橫切面(D)的三維微ct重建表示，跟隨骨沿平面的切割，在C中以虛線表示。

圖1 E：骨體積/組織顯示體積百分比。

圖1 F：三色染色后骨骼切片的組織學(xué)圖像。腫瘤用虛線和*表示骨髓。

圖1 G：腫瘤負(fù)荷/軟組織體積百分比。

結(jié)果顯示，在晚期乳腺癌中，ERRα過表達(dá)組的骨溶解減少，ERRαAF2（ERRα功能域突變）實(shí)驗(yàn)組的骨溶解增加。

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Fig2：晚期乳腺癌細(xì)胞中ERRα的過表達(dá)對(duì)肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生沒有影響

圖2 A：細(xì)胞注射第15天HE染色后小鼠肺的組織學(xué)分析。轉(zhuǎn)移灶用* (B)圖表示3個(gè)不同深度的代表性切片上的肺轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞計(jì)數(shù)。

圖2 C-F：（C和E）壓碎來自用于定量骨轉(zhuǎn)移的同一只小鼠的肺，將釋放的細(xì)胞培養(yǎng)2周。肺轉(zhuǎn)移菌落的代表性圖片和(D和F)是說明所有小鼠形成的肺轉(zhuǎn)移菌落數(shù)量平均值的圖表。

圖2 G：顯示了2周后在肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞集落ERRα的平均表達(dá)。半定量PCR對(duì)n=3只動(dòng)物進(jìn)行3個(gè)重復(fù)的PCR，并對(duì)核糖體蛋白基因L32進(jìn)行歸一化。

考慮到4T1細(xì)胞也定居在肺中，作者分析了ERRα表達(dá)對(duì)LM發(fā)育的影響。結(jié)果與骨骼相反，從肺中提取的LM數(shù)量和BCa菌落數(shù)量均與4T1細(xì)胞中ERRα的表達(dá)水平無關(guān)。（A-F）但是與對(duì)照組相比，4T1-ERRα注射組中觀察到了LM中的ERRα過表達(dá)。

結(jié)合圖1、圖2的結(jié)果，揭示了乳腺癌細(xì)胞中ERRα的過度表達(dá)阻止了它們?cè)诠趋乐械纳L，并提示了乳腺癌中ERRα的表達(dá)可能會(huì)影響骨骼微環(huán)境，從而阻止骨轉(zhuǎn)移進(jìn)展。

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Fig3：晚期乳腺癌細(xì)胞中ERRα的過表達(dá)促進(jìn)CD8 + T細(xì)胞毒性作用

從接種了4T1-CT或4T1-ERRα細(xì)胞的小鼠（n = 4）的轉(zhuǎn)移腿（骨頭）（A，C，D-F）或肺（B，C）制備細(xì)胞懸液。

圖3 A-B：CD45 +造血細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)等高線圖，顯示了T細(xì)胞（CD3 +），B細(xì)胞（CD19 +）和CD4 / CD8 T細(xì)胞的比例，以及代表骨骼中細(xì)胞百分比的圖（A）和肺部（B）。

圖3 C-E：流式細(xì)胞儀等高線圖說明了CD8 + T細(xì)胞中FasL（細(xì)胞凋亡因子），LAMP-1（溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白），粒酶A和B（毒細(xì)胞檢測(cè)因子）以及IFN-β（腫瘤壞死生長因子）的產(chǎn)生。（D）圖形顯示細(xì)胞百分比，（E）顯示其絕對(duì)數(shù)。

圖3 F-G：TUNEL分析后表達(dá)骨的4T1-CT或4T1-ERRα切片的熒光顯微照片以及虛線矩形的放大圖。DAPI染色后，凋亡細(xì)胞顯示為紅色，細(xì)胞核顯示為藍(lán)色。（G，H）比例尺＝50μm，T：腫瘤，GP：具有凋亡性肥大性軟骨細(xì)胞的生長板，由白色箭頭表示。

將接種了4T1-C和4T1-ERRα細(xì)胞的小鼠的腿和肺制備細(xì)胞懸液。通過流式細(xì)胞儀檢

測(cè)B細(xì)胞、T細(xì)胞、毒性、炎癥因子、凋亡等指標(biāo)的差異。結(jié)果顯示，ERRα在BCa細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)影響T細(xì)胞在骨骼中錨定后的穩(wěn)態(tài)。與對(duì)照組相比，ERRα處理組發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。

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Fig4：CD8+ T細(xì)胞消耗恢復(fù)4T1-ERRα骨轉(zhuǎn)移進(jìn)展

圖4 A：流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)加入cd8抗體后，骨中CD8+T細(xì)胞缺失。

圖4 B：拍照顯示4T1-ERRα細(xì)胞接種18天后溶骨性病變情況。溶骨區(qū)用虛線劃分。

圖4 C-E：三維microCT重建脛骨的代表在矢狀部分(C)和橫截面(D)骨沿平面切割。(E)中的虛線所示圖表說明的意思是骨體積/組織體積。

結(jié)果表明，ERRα在BCa細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)影響CD8 + T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，并增加其在骨骼中的抗腫瘤細(xì)胞毒性程序，從而控制腫瘤的進(jìn)展。

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Fig5：ERRα在晚期乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)Ccl17和Ccl20

圖5 A：細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子mRNA在4T1- ERRα細(xì)胞和4T1-ct細(xì)胞中的表達(dá)，與Ppia、Actb和Rplp0的表達(dá)對(duì)照

圖5 B-D：為對(duì)3個(gè)重復(fù)樣本進(jìn)行RT-PCR并對(duì)核糖體蛋白基因L32進(jìn)行歸一化后的相關(guān)基因表達(dá)情況

圖5 E：分析了患有4T1-ERRα和4T1-CT病變的小鼠(n=3)粉碎骨骼后獲得的腫瘤細(xì)胞集落，并在4周內(nèi)培養(yǎng)

圖5 F：4T1-ERRα和4T1-CT細(xì)胞定植的骨切片上Ccl17和Ccl20的免疫染色。T:腫瘤，GP:生長板。

圖5 G：流式細(xì)胞儀等高線圖顯示了CCR4和CCR6在4T1-ERRα細(xì)胞或4T1-CT細(xì)胞定植的骨CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)。

結(jié)論：通過生信分析發(fā)現(xiàn)ERRα在晚期乳腺癌細(xì)胞中可上調(diào)下游Ccl17和Ccl20的表達(dá)，后續(xù)通過QPCR和免疫組化驗(yàn)證。

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Fig6：ERRα在晚期乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)Ccl17和Ccl20

圖6 A：基于涉及免疫系統(tǒng)過程的蛋白質(zhì)的基因本體學(xué)聯(lián)盟提取的信息覆蓋最小網(wǎng)絡(luò)（包含101種蛋白質(zhì)），并創(chuàng)建“特定于對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答的最小網(wǎng)絡(luò)”（包含52個(gè)蛋白質(zhì)）

圖6 B-C：通過對(duì)串?dāng)_子的系統(tǒng)最短路徑定義，確定了ESRRA潛在的新調(diào)控因子VCAM1、MACF1、HUR和TGF-β3。

圖6 D：分析4T1-ERRα、4T1-ERRα-AF2、4T1-CT和4T1-CT(AF2)細(xì)胞

圖6 E：分析了患有4T1-ERRα或4T1-CT病變的小鼠(n = 3)粉碎骨骼后獲得的腫瘤細(xì)胞集落，并在4周內(nèi)培養(yǎng)

圖6 F：Tgf-β3在4T1-ERRα；4T1-CT；4T1-CT（af2）；4T1-ERRαAF2細(xì)胞定植的骨切片上的免疫染色。

圖6 G：用反向激動(dòng)劑XCT-790將4T1-ERRα細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后TGF-β表達(dá)量

圖6 H：對(duì)MCF7和B02克隆的mRNA進(jìn)行RT PCR。顯示了每個(gè)MCF7克隆的三種不同培養(yǎng)物的TGF-β3平均值

圖6 I：流式顯示了4T1-ERRα細(xì)胞或4T1-CT定植的骨CD8+ T細(xì)胞中SMAD2/3的磷酸化。

基于創(chuàng)建的“特定于對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答的最小網(wǎng)絡(luò)”（包含52個(gè)蛋白質(zhì)），對(duì)串?dāng)_子的系統(tǒng)最短路徑定義，確定了兩個(gè)新的ESRRA（ERRα）-CCL17或ESRRA-CCL20相關(guān)的調(diào)節(jié)劑：VCAM和TGF-β 3。結(jié)果表明，ERRα的過表達(dá)抑制了BCa中TGF-β3的表達(dá)，因此可以防止BCa BM在免疫細(xì)胞中產(chǎn)生由TGF-信號(hào)激活提供的免疫抑制微環(huán)境。

整體結(jié)論如下：

1.ERRα在BCa細(xì)胞中的表達(dá)抑制骨轉(zhuǎn)移后的骨溶解；

2.BCa細(xì)胞ERRα的表達(dá)影響骨中的T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)；（募集T細(xì)胞）

3.ERRα表達(dá)導(dǎo)致BCa細(xì)胞中CCL17和CCL20的上調(diào)；

4.ERRα的過表達(dá)抑制了BCa中TGF-β3的表達(dá)，因此可以防止BCa BM在免疫細(xì)胞中產(chǎn)生由TGF-信號(hào)激活提供的免疫抑制微環(huán)境。