Co-IP、ChIP、RIP、Pulldown作為常見的關系驗證方法。它們可以從檢驗的出發(fā)點來區(qū)分：co-IP、ChIP、RIP是利用已知的蛋白檢測體內相關蛋白、DNA、RNA，并通過蛋白抗體免疫沉淀分離目標蛋白、DNA、RNA。Pulldown則是根據(jù)已知RNA（RNA pulldown）或者已知蛋白（GST pulldown）體外檢驗相關蛋白。

免疫共沉淀co-IP

抗體與細胞裂解液或蛋白表達上清中相應的蛋白結合后，再與蛋白A/G（ProteinA/G）（或二抗）偶聯(lián)的瓊脂糖微珠孵育，通過離心得到微珠-蛋白A/G（或二抗）-抗體-目的蛋白復合物。復合物沉淀經(jīng)離心洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，沸水浴5-10 min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體（輕鏈和重鏈已斷開）和靶標蛋白。該上清混合物經(jīng)SDS-PAGE電泳分離和Western blotting顯影，最終依據(jù)顯影后的膠片上是否有目的蛋白條帶，來判斷免疫沉淀實驗是否成功。

實驗方法

Step1: 蛋白樣品準備，細胞需提前裂解

Step2: 抗原抗體結合

Step3: protein A 瓊脂糖珠與抗體結合

Step4: 免疫沉淀分離

Step5: 洗脫蛋白復合物

Step6: WB或質譜分析

染色質免疫沉淀ChIP

ChIP是目前唯一研究體內DNA與蛋白質相互作用的方法。在生理狀態(tài)下，把細胞內的DNA與蛋白質交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應， 將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來，以富集存在組蛋白修飾或者轉錄調控的DNA片段，再通過多種下游檢測技術（定量PCR、基因芯片、測序等）來檢測此富集片段的DNA序列。

實驗方法

Step1: 交聯(lián)蛋白與DNA

Step2: 超聲破碎使染色質片段化

Step3:細胞裂解

Step4: 抗體結合特定蛋白抗原

Step5: 通過beads沉淀復合物并洗脫

Step6: qPCR擴增或基因測序

RNA免疫沉淀RIP

主要是用來研究體內RNA與蛋白結合情況，利用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來，通過分離純化，對結合在復合物上的RNA 進行RT-PCR驗證或測序分析，了解轉錄后調控網(wǎng)絡動態(tài)過程。

實驗方法

Step1：靶蛋白-RNA交聯(lián)形成復合物（RNP）超聲剪切RNA鏈成小段

Step2：細胞裂解，將RNP與抗體、微珠連接

Step3：微珠-抗體-RNP形成沉淀

Step4：將RNP從微珠-抗體上洗脫，并將RNA與蛋白解交聯(lián)，純化RNA

Step5：qPCR檢測或測序分析

RNA Pulldown

RNA Pulldown是研究RNA與蛋白質相互作用的一種技術。利用生物素標記的RNA探針，通過與含有目的蛋白的溶液孵育，形成RNA-蛋白質復合物。復合物可以特異性結合磁珠，從而與孵育液中的其他蛋白分離。復合物洗脫后，通過蛋白凝膠電泳實驗，檢測特定的RNA與蛋白的結合情況。

實驗方法

Step1：生物素標記目標目標RNA；

Step2：磁珠結合目標RNA；

Step3：目標RNA與蛋白結合；

Step4：通過磁場固定磁珠，將蛋白分離純化；

Step5：通過WB鑒定或質譜檢測。

GST Pulldown

GST Pulldown將靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巰基轉移酶）融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物，充當一種“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白)，洗脫結合物后通過SDS-PAGE電泳分析，從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白，“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細胞裂解物、純化蛋白、表達系統(tǒng)以及體外轉錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。

體外檢測蛋白質與蛋白質之間相互作用，用于驗證兩個已知蛋白的相互作用，或者篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。

實驗方法

Step1：Glutathione瓊脂糖珠預處理；

Step2：GST融合蛋白掛柱；

Step3：細胞裂解；

Step4：將細胞裂解液上清加入beads；

Step5：加上SDS上樣緩沖液；

Step6：SDS-PAGE，Western Blot或者質譜儀分析。

案例展示

ChIP案例分析：

1. 陽性對照組條帶清晰可見，陰性對照組正常，表明CHIP實驗操作可行；

2. input對照組條帶清晰可見，表明PCR擴增引物可用；

3. 抗體A實驗組有目的條帶，表明基因與轉錄抑制因子蛋白均可發(fā)生結合。

RIP案例分析：

1. 陽性對照組條帶清晰可見，陰性對照組正常，表明RIP實驗操作可行；

2. input對照組條帶清晰可見，表明PCR擴增引物可用；

3. 抗體A實驗組有目的條帶，表明RNA與蛋白可發(fā)生結合。