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        活性氧檢測熒光法實驗步驟由普拉特澤生物為大家總結(jié)分享?；钚匝跏且环N含氧的生物活性分子，在細(xì)胞信號通路、轉(zhuǎn)錄等方面發(fā)揮重要的調(diào)控功能，如細(xì)胞凋亡、自噬、衰老、癌癥等都與細(xì)胞活性氧有關(guān)，所以進(jìn)行細(xì)胞活性氧的檢測是生命科學(xué)領(lǐng)域中的研究重點(diǎn)。普拉特澤生物為廣大生命科學(xué)研究人員提供活性檢測外包服務(wù)，可根據(jù)實方案的要求選擇不同的檢測方法，本文就跟大家一起學(xué)習(xí)用與自由基反應(yīng)性染料（熒光法）檢測活性氧的方法：

        一、熒光法檢測活性氧實驗原理

        活性氧檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit，也稱ROS Assay Kit)是一種利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測的 試劑盒。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH 不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF 的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。

        二、熒光法檢測活性氧實驗步驟

        1、細(xì)胞復(fù)蘇

        (1) 將ddH₂O預(yù)溫至37℃。

        (2) 戴上手套和口罩帽子，從液氮罐中取出裝有目的細(xì)胞的凍存管（內(nèi)有1 mL細(xì)胞混合液），立即投入37℃ ddH₂O中，輕搖凍存管使之在1分鐘內(nèi)快速溶解。

        (3) 完全溶解后，75%酒精擦拭凍存管外壁消毒后帶進(jìn)超凈臺。

        (4) 在超凈臺中，在15 mL滅菌離心管中預(yù)先加入10 mL新鮮配制的培養(yǎng)基，打開凍存管，將所有凍融的細(xì)胞懸液加入該離心管中，常溫1000 rpm離心3分鐘，吸除上層的培養(yǎng)液。

        (5) 1mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻后加入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)基至5 mL，置于37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

        (6) 48小時后換液，細(xì)胞融合接近80%時即可傳代。

        2、細(xì)胞培養(yǎng)

        根據(jù)待測細(xì)胞的種類，選擇合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)，操作過程保持無菌。

        3、活性氧檢測

        (1) 按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μM；

        (2) 去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA；

        (3) 37度培養(yǎng)箱中孵育15-20 min，用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次；

        (4) 置于顯微鏡下觀察拍照。

        4、活性氧檢測注意事項

        (1) 試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再使用。

        (2) 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封(低溫干燥)保存。

        (3)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液即可視為陰性對照或者空白:預(yù)處理后的樣本無需稀釋。

        (4)嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

        (5)所有液體組分使用前充分搖勻。

        (6)活性氧檢測必須使用活細(xì)胞。

        好啦，那熒光法檢測細(xì)胞活性氧的實驗步驟咱們就分享完啦，試劑操作可根據(jù)實細(xì)胞調(diào)整合適，如果您有實驗步驟上的問題或有活性氧（ROS）檢測外包的需求，歡迎給客服留言，普拉特澤生物技術(shù)會第一時間給到回復(fù)發(fā)您活性氧檢測的相關(guān)資料。下期繼續(xù)分享活性氧檢測中最常用的化學(xué)發(fā)光法，下期見~