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利用熒光標記的二級抗體（即二抗）與目標抗原結合，從而實現(xiàn)對特定蛋白質的檢測。普拉特澤生物承接等病理染色相關服務上萬例，積累了操作大量經驗，為大家詳細分享免疫熒光實驗方法，同時為廣大科研工作者開展線上的理論培訓與線下實操，可承接免疫熒光實驗外包服務

一、免疫熒光二抗法VS TSA法

二抗法

熒光二抗法是利用熒光標記的二級抗體(即二抗)與目標抗原結合，從而實現(xiàn)對特定蛋白質的檢測。操作相對簡單，適用于多種樣本和抗體，缺點是信號強度可能受一抗和二抗結合效率的影響，對低豐度抗原信號較弱。

TSA法

TSA法是一種信號放大技術，其主要原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(即熒光標記的酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結合位點)，產生大量的酶促反應，該產物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸、酪氨酸殘基)結合，在抗原-抗體結合部位形成大量的熒光素沉積，實現(xiàn)信號放大。還可以通過多次重復免疫標記，使用不同的熒光酪胺實現(xiàn)多重熒光染色。同時也適用于相同來源一抗的雙重熒光免疫標記。

二、TSA實驗流程
1、石蠟切片脫蠟至水:依次將石蠟切片放入環(huán)保型脫蠟液l10min-環(huán)保型脫蠟液I10min-環(huán)保型脫蠟液I 10min-無水乙醇15min-無水乙醇115min-無水乙醇I 5min-蒸餾水洗。

2、抗原修復:組織切片置于盛滿抗原修復緩沖液的抗原修復盒中于微波爐內進行抗原修復。維持緩沖液沸騰10min左右，此過程中防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PH7.4PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(這里是以微波加熱法抗原修復方式為例，具體修復方式需根據組織類型及抗體種類選擇對應的抗原修復液及修復方式)

3、雙氧水封閉:切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫圈(防止試劑流走)，切片平放于避光濕盒滴加3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min左右，封閉內源性過氧化物酶。將玻片置于PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

4、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

5、加一抗:輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于透明濕盒內4°C孵育過夜(濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā))。
6、加對應種屬HRP標記二抗:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。
7.加iF488-TSA工作液:將玻片置于PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加配制好的iF488-TSA工作液，避光室溫孵育10 min。孵育完后玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5 min

8.抗體洗脫

8.1微波處理:組織切片置于盛滿抗原修復液(根據組織類型及抗體選擇合適的抗原修復液)的修復盒中進行微波加熱處理，去除已經結合的一抗二抗。(加熱的溫度和時間建議:加熱到95℃以上，維持15分鐘。)此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。
8.2洗脫處理:切片稍甩干后將恢復至室溫的抗體洗脫液鋪滿整個組織，室溫孵育5 min后去除抗體洗脫液，再次滴加足量的抗體洗脫液完全覆蓋組織，37°C孵育30 min，孵育完成后將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。
9.血清封閉:切片稍微甩干后，向組織上滴加3%BSA或血清室溫封閉30 min，具體根據第二種一抗及對應的二抗種屬決定封閉試劑。

10.加第二種一抗:在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。(濕盒底部加少量水防止抗體蒸發(fā))。

11.加對應的HRP標記的二抗:玻片置于PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min.

12.加iF555-TSA:玻片置于PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加配制好的iF555-TSA工作液，避光室溫孵育10 min。孵育完后，玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。
13.DAPI復染細胞核:切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。14.自發(fā)熒光淬滅:玻片置于PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后，在圈內加入組織自發(fā)熒光淬滅劑避光孵育5 min，流水沖洗10 min。15.封片:切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

16.鏡檢拍照:切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，也可用熒光掃描儀掃描成像。切片置于避光切片盒內4℃可保存15天。

三、TSA法實驗注意事項

1.與二抗相比，TSA 試劑具有更高的靈敏度和更強的信號放大效果。因此一抗使用濃度需降低，一般在抗體說明書建議的稀釋比基礎上再擴大5-10倍，以減少非特異性結合導致的背景熒光。建議設置一抗梯度濃度獲得最佳效果。

2.如背景熒光較強，建議增加組織自發(fā)熒光淬滅步驟。

3.熒光Tyramide的建議稀釋比是1:500,0檢驗結果調整稀釋比例(調整范圍1:1000)。

4.為保證抗體洗脫效果及熒光多重標記效果，正式多重標記之前需分別做各個抗體的TSA單標測試(即一抗-HRP二抗一對應多中的TSA)，確定每個抗體單標都能做出較理想的陽性后再根據單標測試結果去確定多標的抗原修復條件，抗體順序等實驗條件
5.如果有些抗體效價高，親和力較強，不洗脫徹底，可提高洗滌溫度至50℃ 30 min或增加洗脫次數，即組織上加入抗體洗脫液37℃孵育 30 min后，去掉抗體洗脫液，再入新的抗體洗脫液，繼續(xù) 37℃孵育 30 min6.抗體洗脫液流動性強，片子未水平放置時，試劑易流出圈外，影響洗脫效果，需在操作過程注意切片平放。

6..操時需帶手套，口罩，穿實驗服，避免話劑接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸到敏感區(qū)域，立即用大量清水沖洗。

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