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從零開始教你養(yǎng)細菌，一文掌握細菌培養(yǎng)核心要點

Question：細菌該如何培養(yǎng)？（普拉特澤生物提供長期穩(wěn)定的細胞實驗外包服務）

答：

1 實驗背景

細菌培養(yǎng)被廣泛應用于生物化學與分子生物學的實驗，例如基因克隆與表達、DNA與RNA的提取、酶的生產(chǎn)、細菌與細胞共培養(yǎng)等。下面以基因克隆表達中大腸桿菌（生長周期短）的培養(yǎng)、鳥分枝桿菌（生長周期長）的培養(yǎng)為例分享主要的實驗步驟和注意事項：

圖片來源：https://www.atcc.org/resources/culture-guides/bacteriology-culture-guide

2 實驗步驟

2.1 準備工作

（1）培養(yǎng)基準備：LB培養(yǎng)基（大腸桿菌）、Middle brook培養(yǎng)基（鳥分枝桿菌）

（2）試劑準備：蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂、購買Middle brook 7H10固體培養(yǎng)基和Middle Brook 7H9肉湯培養(yǎng)基、蒸餾水、抗生素（氨芐青霉素、羧芐青霉素、兩性霉素B）、購買增菌液。

（3）儀器、耗材準備：細菌培養(yǎng)皿、50mL無菌離心管、試管、錐形瓶、接種環(huán)、酒精燈、打火機、高壓蒸汽滅菌鍋、37℃恒溫培養(yǎng)箱、生物安全柜、超凈工作臺、恒溫搖床。

2.2 實驗步驟

（1）滅菌：按照下面成分（見表1）配置培養(yǎng)基，使用高壓蒸汽滅菌法121℃、30min進行滅菌處理。接著將準備的細菌培養(yǎng)皿、50mL無菌離心管、錐形瓶、接種環(huán)、酒精燈等物品放置在超凈工作臺打開紫外線照射至少30min。

（2）培養(yǎng)基配置比例：培養(yǎng)基的配置需要按照質(zhì)量比例要求例如LB培養(yǎng)基需按照質(zhì)量（g）比（2:1:2）分別稱取蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉，購買的分枝桿菌培養(yǎng)基按照說明書根據(jù)使用的量進行配置。固體培養(yǎng)基的配置加入瓊脂粉一般按照15.0 g/L的比例加入。

（3）倒平板：根據(jù)細菌的生長狀況設置平板的厚度，培養(yǎng)基的量通常的大腸桿菌10mL/平板（培養(yǎng)基層厚度約3-4mm），而分枝桿菌需要20mL/平板（培養(yǎng)基層厚度約5-6mm）。

（4）活化、接種：菌種的來源可以是涂布的平板也可以是保存在-80℃的菌種。關閉紫外線，打開超凈工作臺通風，點燃酒精燈，將接種環(huán)放置在酒精燈上灼燒至紅色，放置在火焰周圍冷卻。挑取適量菌落或者菌液進行劃線，使得菌液以多至少的量（圖1）分布在培養(yǎng)基表面。

（5）培養(yǎng)：可將處理好的培養(yǎng)基用封口膜封閉好，正置37℃恒溫培養(yǎng)箱30min左右，然后倒置培養(yǎng)。

（6）觀察：按照細菌的生長周期觀察期生長狀況，大腸桿菌一般需要12~16h，而分枝桿菌生長緩慢需要1~4周左右。

（7）液體培養(yǎng)：一般在活化、接種后，劃線的平板長出清晰的單克隆菌落，此時我們可以挑取單菌落進行擴大培養(yǎng)。將液體培養(yǎng)基按15~20mL的量倒入無菌離心管或者10mL左右倒入試管，在灼燒接種環(huán)滅菌冷卻后將菌落挑取伸入試管輕輕晃動，使菌落落入液體培養(yǎng)基，封口膜封閉試管或者離心管；最后放置恒溫搖床進行培養(yǎng)。

3 注意事項

（1）細菌培養(yǎng)要求所涉及的物品、操作均要求無菌，否則會存在其他雜菌的污染。

（2）滅菌之前注意按照菌的生長情況調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值例如LB培養(yǎng)基要求PH值在7.0~7.4之間，防止偏酸或者偏堿的環(huán)境影響菌的生長。

（3）培養(yǎng)基配置時，使用蒸餾水充分溶解；滅菌完成后，固體培養(yǎng)基可以暫放烘干箱后倒平板。

（4）抗生素、增菌液一定是等待培養(yǎng)基稍稍冷卻至手可以正常觸碰錐形時加入，否則抗生素會失效。

（5）所使用的物品基本上放置在酒精燈的周圍，例如倒平板時，灼燒瓶口后一手操作平板一手操作錐形瓶倒平板（圖2）。

（6）為了防止平板產(chǎn)生水汽，可以將平板半敞開在酒精燈周圍，也可以全部疊放在酒精燈的旁邊（圖3）

（7）分枝桿菌生長周期長，需要按照說明書的比例加入增菌液、抗生素以及倒厚平板，保證長時間的培養(yǎng)有足夠營養(yǎng)成分和良好的生長環(huán)境。

（8）鳥分枝桿菌屬于非結(jié)核分枝桿菌，存在一定的感染性，使用前需要用60℃水浴滅活30min，同時在生物安全柜中進行操作，防止感染。

（9）在實驗操作過程中，需佩戴好手套、口罩、穿好實驗服等。

（10）平板處理，有一定感染性的平板需要集中滅菌處理后再丟棄。

（11）注意標記平板，一般標記好時間、菌種名稱、培養(yǎng)條件等。
注：文源公眾號實驗老司機

冰凍三尺，非一日之寒，普拉特澤致力于幫助廣大科研工作者解細胞培養(yǎng)中的各方面問題，不但授人以魚，亦授人以漁。