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   上一篇給大家介紹了研究細(xì)胞遷移時(shí)應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法之一一細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，今天我們介紹另一種同樣是應(yīng)用最為廣泛的方法之一―Transwell小室實(shí)驗(yàn)。

一、Transwell小室實(shí)驗(yàn)原理

1、Transwell-遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell小室上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會(huì)向營(yíng)養(yǎng)成分高的下室跑，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。

2、Transwell-侵襲實(shí)驗(yàn)：在Transwell上室膜上鋪上一層基質(zhì)膠，會(huì)形成一層膜結(jié)構(gòu)，與天然的基質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)極為相似；上室種細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，細(xì)胞不能自由穿過，先要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)通過變形運(yùn)動(dòng)才能穿過鋪有Matrigel的濾膜。

二、Transwell小室實(shí)驗(yàn)操作步驟

步驟詳解：

a、基質(zhì)膠準(zhǔn)備：提前一晚將基質(zhì)膠放入4℃過夜融化；用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠(冰上操作，槍頭預(yù)冷)；上室各加100uL(20-30ug/孔)，放入37℃培養(yǎng)箱中待其凝固，出現(xiàn)“白色層”；

b、Transwell小室處理：用無血清培養(yǎng)基洗Matrigel2次；

c、鋪板：每孔上室加入150μL細(xì)胞懸液，下室加入500uL完全培養(yǎng)基；鋪板密度遷移實(shí)驗(yàn)建議每板鋪7000個(gè)，侵襲實(shí)驗(yàn)建議每板鋪70000個(gè)；

d、固定：取出小室，用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15~30 min；

e、染色：取出小室，用PBS洗2次，結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗2次；

f、拍照：100×拍照。

三、Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

1、圖片展示及計(jì)數(shù)

2、遷移率計(jì)算及柱狀圖展示

遷移率=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)

四、Transwell小室實(shí)驗(yàn)適用范圍

(1)共培養(yǎng)體系：小于3.0μm孔徑條件下，細(xì)胞不會(huì)遷移通過，因此，若研究不涉及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力，不需要細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜，則應(yīng)選擇3.0μm以下孔徑，常用0.4、3.0μm；將細(xì)胞A種于上室，細(xì)胞B種于下室，可以研究細(xì)胞A、B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)彼此的影響；

(2)腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：常用8.0、12.0μm膜，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會(huì)向營(yíng)養(yǎng)成分高的下室跑，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力；

(3)腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：常用8.0、12.0μm膜，原理與腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)類似；與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)不同的是，聚碳酸酯膜上室側(cè)鋪上一層基質(zhì)膠，用以模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)。

注意：細(xì)胞遷移是涉及多個(gè)步驟、高度完整的過程，在癌癥轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈粥樣硬化和關(guān)節(jié)炎等疾病惡化中起重要作用；遷移能力強(qiáng)的細(xì)胞其侵襲能力不一定強(qiáng)；反則成立。

五、Transwell小室實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)及常見問題

1、鋪基質(zhì)膠時(shí)應(yīng)注意的問題

Matrige在溫度過高或過低的情況下易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應(yīng)提前在4℃預(yù)冷。用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，上室加100μL(20-30pg/孔)放入37℃培養(yǎng)箱中待其凝固，出現(xiàn)“白色層”；

2、遷移過程中出現(xiàn)氣泡應(yīng)該處理氣泡會(huì)使下層培養(yǎng)液的趨化作用減弱，出現(xiàn)氣泡時(shí)將小室取出用槍頭戳破或吸出，再將小室放回。

注意事項(xiàng)1：確定單一趨化因素、血清、藥物或特定趨化因子等；

注意事項(xiàng)2：遷移或侵襲實(shí)驗(yàn)最終細(xì)胞形態(tài)可能會(huì)改變；

注意事項(xiàng)3：把控接種密度和遷移/侵襲時(shí)間。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的操作步驟及適用范圍【附視頻教程】點(diǎn)此跳轉(zhuǎn)

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