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一、M1和M2型巨噬細(xì)胞簡(jiǎn)介

巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長(zhǎng)期生存。

巨噬細(xì)胞是一種位于組織內(nèi)的白血球，源自單核細(xì)胞，而單核細(xì)胞又來源于骨髓中的前體細(xì)胞。巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞皆為吞噬細(xì)胞，在脊椎動(dòng)物體內(nèi)參與非特異性防衛(wèi)（先天性免疫）和特異性防衛(wèi)（細(xì)胞免疫）。它們的主要功能是以固定細(xì)胞或游離細(xì)胞的形式對(duì)細(xì)胞殘片及病原體進(jìn)行噬菌作用（即吞噬以及消化），并激活淋巴球或其他免疫細(xì)胞，令其對(duì)病原體作出反應(yīng)。

南京醫(yī)科大學(xué)的楊碩教授報(bào)告了E3泛素連接酶Pellino3通過抑制TRAF6介導(dǎo)的泛素化和HIF1a的穩(wěn)定來負(fù)向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M1極化以及IL-1β的產(chǎn)生，最終降低胰島素抵抗，阻止糖尿病發(fā)生的研究成果。值得注意的是，nature雜志最近發(fā)文證明了去除Treg細(xì)胞后可阻止衰老相關(guān)的肥胖、胰島素抵抗以及糖尿病的發(fā)生發(fā)展。因此，慢性炎癥在不同原因引起的二型糖尿病中的作用也可能是不一樣。

事實(shí)上，巨噬細(xì)胞極化還可參與腫瘤、感染性疾病以及組織的損傷和修復(fù)等生理病理過程。巨噬細(xì)胞在不同的微環(huán)境中可分化為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞 。M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)MHC II、CD80、CD86和 CD16/32，分泌TNF-α、IL-6和IL-12等促炎因子，以及CXCL9、CXCL10和CXCL11等趨化因子。另外，M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)arginase-1(Arg1)和CD206，分泌抗炎因子IL-10以及CCL2、CCL17和CCL22等趨化因子 。

二、腹腔中M1和M2型巨噬細(xì)胞流式染色實(shí)例

Mouse (腹腔貼壁細(xì)胞): M1和M2型巨噬細(xì)胞

1.標(biāo)志物：M1: F4/80⁺CD11b⁺CD86⁺ cells；M2: F4/80⁺CD11b⁺CD206⁺cells；

2.流式細(xì)胞儀：Beckman Coulter，CytoFLEX；

3.流式抗體及用量：PE anti-mouse CD86(1μg/test，105007，BioLegend)；APC anti-mouse CD206 (0.5μg/test，141707，BioLegend)；PerCP-Cy5.5 anti-mouseCD11b (0.25μg/test，101227，BioLegend)； AF488 anti-mouse F4/80 (1μg/test，123119，BioLegend)；

4.染色條件：首先FcRblock孵育(1μg/test；101319；BioLegend)，4℃，5-10min； 接著F4/80、CD11b、CD86表面染色， 4℃，30min；

5.細(xì)胞固定：PBS洗滌細(xì)胞2~3次，加入細(xì)胞固定液（Fixation Buffer，500ul，420801，BioLegend）室溫避光固定30min。

6.細(xì)胞膜通透：150g離心5min棄掉固定液，加入2ml用ddH₂O 10倍稀釋后的10×Intracellular Staining PermeabilizationWash Buffer（421002，BioLegend）重懸細(xì)胞，150g離心5min棄上清，重復(fù)步驟2~3次。

7.胞內(nèi)染色：100μL1×Intracellular Staining PermeabilizationWash Buffer重懸細(xì)胞，加入CD206抗體（0.5μg/tests，141707，BioLegend），室溫避光孵育30min。孵育完畢后，2ml1×Intracellular Staining PermeabilizationWash Buffer洗滌細(xì)胞2~3次，加入500μL cell staining buffer重懸細(xì)胞，上機(jī)。

8.分析軟件：Flowjo (10.0.7)；

9.圈門策略及染色: (見下圖)。