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巨噬細胞分離與純化實驗步驟由普拉特澤生物跟大家一起學習。巨噬細胞是一種位于組織內的白血球，源自單核細胞，是生物體免疫系統(tǒng)中非常重要的一部分。巨噬細胞一直是生物醫(yī)學科研人員的研究重點，普拉特澤生物流式檢測平臺為廣大科研人員提供巨噬細胞實驗外包服務，本文咱們先來看看巨噬細胞的分離與純化步驟吧：

一、細胞分離

1、取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）無菌的液體石蠟或巰基乙酸肉湯或4%淀粉肉湯。3～4天以后收集腹腔細胞。

2、如要收集腹腔靜置巨噬細胞，不注射刺激物，直接從一步開始。放血處死動物，以減少腹腔中的紅細胞。消毒腹部，沿腹中線注入3～4mL（豚鼠20～40ml，家兔50～70mL）冰中預冷的無菌PBS-H（含10U/mL肝素和10%小牛血清的PBS）。輕輕按摩腹部5分鐘。

3、以下均無菌操作。剪開腹壁，用吸管吸出滲出液，再用同樣容量的預冷PBS-H沖洗腹腔2～3次。合并滲出液于離心管中，4℃離心250×g 10分鐘，去上清液。

4、用預冷的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細胞3次，每次4℃離心250×g 10分鐘，去上清液。用預冷的適量RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細胞，臺盼藍染色計數(shù)細胞并決定細胞活力。

二、巨噬細胞的分離和純化

1、取2～3公斤重的家兔，耳緣靜脈注射10 mL空氣處死動物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉動物。仰臥固定，消毒胸部，剪開胸壁。以下過程注意無菌操作。小心從環(huán)狀軟骨下方剪下氣管，分離心臟和血管，取出肺，剪去脂肪和結締組織。用無菌紗布小心擦凈肺表面，稱重。

2、分離肺泡巨噬細胞：用夾子夾住氣管，使肺懸空。向氣管中注射40ml無菌的冷生理鹽水，讓生理鹽水進入全部肺泡。用鑷子提起氣管，從夾子下面剪斷氣管，將肺中的液體倒入離心管中。再用同樣方法，用40 mL無菌冷生理鹽水沖洗肺泡，合并浸出液，置4℃。

3、分離肺組織中的巨噬細胞：取出肺泡巨噬細胞后，剪去氣管，將肺組織放在有冷RPMI-1640培養(yǎng)液的平皿中。平皿置冰上，用吸滿冷RPMI-1640培養(yǎng)液的20 mL注射器接23號針頭，一邊灌注一邊用針頭梳離肺組織，直到肺組織與支氣管樹全部分離。使肺組織通過00目的鋼絲網(wǎng)，分離單細胞。

4、以下過程均在4℃中進行。分別處移動圖片理肺泡巨噬細胞和肺組織中的巨噬細胞：離心200×g10分鐘，去上清液。輕彈試管，懸浮細胞，加入10 mL低滲液（20mmol/LTris，0.75%氯化銨，pH7.4），37℃處理3～5分鐘，溶解紅細胞。紅細胞通常分別占肺泡巨噬細胞和組織巨噬細胞的1%和10%。也可以不用低滲處理，直接在淋巴細胞分離液上分離巨噬細胞。

5、離心200×g10分鐘，去上清液。用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細胞一次。將細胞懸液加在淋巴細胞分離液（比重1.077）上，離心400×g20分鐘，收集交界面的巨噬細胞。棄去沉淀的死細胞和紅細胞。

6、用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌巨噬細胞2次。臺盼藍染色檢測細胞活力和細胞數(shù)，將細胞配成所需濃度。此時巨噬細胞活力可達90%以上，巨噬細胞占全部細胞的90%以上。

好啦，巨噬細胞的分離純化實驗咱們就講解到這里啦，如果您還有什么其他的問題或有巨噬細胞外包的需求歡迎直接留言，普拉特澤生物隨時為您服務~

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